[发明专利]一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用

权利要求书

1.一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)中得到的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组表达工程菌株；

(3)将步骤(2)中得到的工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后再次离心收集上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；

(4)将步骤(3)得到的融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对透析后的融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析，获得不带标签的高纯度Brevinin-2GUb多肽。

2.根据权利要求1所述的重组表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述Brevinin-2GUb的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.根据权利要求1所述的重组表达方法，其特征在于，步骤(1)所述重组表达载体的构建如下：

以合成的含有Brevinin-2GUb基因的质粒为模板，以Bre-F/R为引物对通过PCR技术扩增得到Brevinin-2GUb基因，并通过RF克隆将Brevinin-2GUb和pET32系列载体连接，构建出重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb。

4.根据权利要求3所述的重组表达方法，其特征在于，所述Bre-F/R的序列如下：

Bre-F：5'-ACGACGACGACAAGGCCATGGGTGTTATTATTGATACTCTGAAAG-3'

Bre-R：5'-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCAAGAGTTGGTGCAGTTTGCAGTG-3' 。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导表达的条件为：12～40℃诱导表达5～25h，诱导剂为IPTG，浓度为0.1～2mM。

6.根据权利要求5所述的重组表达方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16±2℃诱导表达20±2h，所述IPTG浓度为1mM。

7.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤(4)所述肠激酶酶切的条件为：在4℃～30℃条件下，肠激酶的用量为1U/mg～3U/mg融合蛋白，酶切时间为12-36h。

8.根据权利要求7所述的重组表达方法，其特征在于，所述肠激酶酶切的条件为：25℃下，2U/mg肠激酶酶切融合蛋白24h。

9.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述pET32系列载体为pET32a、pET32b、pET32c载体；步骤(2)所述大肠杆菌为BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)Rosetta系列。

10.根据权利要求1～9任一项方法制备的Brevinin-2GUb多肽在制备降糖口服液及多肽药物中的应用。