[发明专利]一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用

说明书

本发明属于基因工程和生物制药领域，公开了一种Brevinin‑2GUb多肽的重组表达方法，包括：(1)将Brevinin‑2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、组蛋白标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中获得重组表达载体；(2)将重组表达载体转化至大肠杆菌获得重组表达工程菌株；(3)将工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体、破碎，离心获得上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；(4)将融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析后浓缩，获得不带标签的目的多肽。该多肽在低浓度下即可对INS‑1细胞具有显著促胰岛素分泌活性，可用于制备降糖多肽药物。

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用。

背景技术

近几十年来，全球成年人糖尿病的患病率持续上升(Ogurtsova K.IDF DiabetesAtlas:Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015and 2040[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2017,128:40-50)。随着经济发展和人们生活水平的提高，糖尿病已经成为全世界范围内最常见的慢性病之一。根据国际糖尿病联合会(IDF)估计，2017年全球有4.51亿(18-99岁)糖尿病患者，预计到2045年，糖尿病患者数量将增至6.93亿(Cho NH.IDF Diabetes Atlas:Global estimates of diabetesprevalence for 2017and projections for 2045[J].Diabetes Research and ClinicalPractice,2018,138:271-281)。在糖尿病患者中，有80％-90％属于II型糖尿病患者。由于目前临床治疗II型糖尿病的药物如磺酰脲类、二甲双胍类和格列奈类等疗效有限，且会出现耐受性和毒副作用，因此开发能够调节糖代谢并显著降低毒副作用的生物活性多肽用于治疗糖尿病成为国内外的研究热点。

蛙皮素多肽Brevinin-2GUb是在2008年从亚洲青蛙Hylaranaguntheri的皮肤分泌物中分离出来的抗菌肽，属于Brevinin-2家族，由30个氨基酸所构成，是一种两亲性的阳离子多肽。已有研究表明，人工合成的Brevinin-2GUb在浓度为100nM时，可以显著增加BRIN-BD11细胞释放胰岛素的速度(Conlon JM.A potent,non-toxic insulin-releasingpeptide isolated from an extract of the skin of the Asian frog,Hylaranaguntheri(Anura:Ranidae)[J].Regulatory Peptides,2008,151:153-159)。此外，人工合成的Brevinin-2GUb能够显著促进正常大鼠的胰岛素分泌，但对体重、血糖没有显著影响；糖尿病大鼠组中，注射Brevinin-2GUb后，大鼠的体重显著上升、胰岛素水平均有明显升高，血糖明显降低(周庆峰.蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对2型糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响[J].中国老年学杂志,2013,33:5904-5906)。因此，Brevinin-2GUb多肽在治疗II型糖尿病方面具有良好的应用前景。

由于从蛙类皮肤分泌物中分离纯化Brevinin-2GUb的程序复杂，产量很低，且提取难度大；人工合成具有生物活性的多肽是快速获得多肽的另一种重要手段，但人工合成成本高，每个氨基酸大约200元左右。大肠杆菌是表达异源重组蛋白应用最为广泛的宿主之一，大肠杆菌表达系统具有表达蛋白高效、发酵条件易控制、表达成本低等优势。因此用基因工程的生物方法在大肠杆菌表达系统中实现Brevinin-2GUb的重组表达并研究其对INS-1细胞的促胰岛素分泌活性，在其用于制备降糖多肽药物方面具有重大的理论意义和经济效益。

发明内容