[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用

权利要求书

1.一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的应用，所述应用为参与球虫子孢子入侵DF-1细胞的作用，所述柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示，核酸序列如SEQ ID No：12或SEQ ID No：13所示。

2.如权利要求1的一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的应用，所述应用为：利用外源表达系统表达纯化柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白，用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体，并利用这种抗体实现对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用。

3.如权利要求2所述的应用，具体为：

(1)使用TRIzol试剂根据使用说明书从未孢子化卵囊中提取总RNA；采用分光光度计在260nm处测定总RNA浓度；采用1％琼脂糖凝胶进行电泳评估RNA质量；采用Super ScriptIII RT试剂，用未孢子化卵囊总RNA合成互补DNA；

(2)使用分别带有限制性酶切位点BamHI和SalI上游引物5′-GCGGATCCATGAGCTCAGAGCAACACGAAAACGAAAGGCCTTCTGCTCCGCCCTTGTGTGCGAAGAACTGCGGCTT-3′和下游引物5′-GCGTCGACTCAAAGCTTCTGGAGTTTGTCTG-3′采用PCR扩增EtAN1-ZnFPORF序列；

(3)用BamHI/SalI对扩增的片段和pGEX-4T-1载体进行双酶切，将BamHI/SalI双重消化的EtAN1-ZnFP片段和pGEX-4T-1载体进行琼脂糖凝胶回收，连接后将重组pGEX-4T-EtAN1-ZnFP质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；将测序正确后的菌落在37℃扩大培养，培养至OD值至0.6-1.0之间时加入1.0mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导表达8h；冰浴超声裂解菌体，超声 2s，停2s，持续20min；

(4)使用谷胱甘肽亲和层析介质纯化rEtAN1-ZnFP蛋白；

(5)取200μg纯化的rEtAN1-ZnFP用等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫2个月大的新西兰白兔；两周后，进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂进行乳化；每7天进行一次免疫，总共进行5次免疫；于最后一次免疫后7天，收集血液，分离多克隆抗体血清；

(6)接种DF-1细胞，每孔3×10⁵个细胞，于24孔板，加入1mL完全培养基，含有10％胎牛血清，100单位/mL双抗，在37℃细胞培养箱中培养16小时；使用ProteinA+G琼脂糖纯化抗体，通过BCA蛋白质测定试剂盒测定IgG的浓度；使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯标记将新鲜纯化的子孢子，设置50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL4个抗体浓度梯度，向子孢子中分别加入纯化好的抗EtZN1-ZnFP IgG，37℃孵育2h。