[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用

说明书

本发明提供一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用，对柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白进行克隆，表达和纯化。通过荧光定量PCR(qPCR)检测EtAN1‑ZnFP在虫体不同发育阶段的转录水平，通过免疫保护实验评估EtAN1‑ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。本研究结果表明EtAN1‑ZnFP可能参与了柔嫩艾美耳球虫的入侵和生长发育。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用。

背景技术

原生动物寄生虫柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是鸡球虫病的主要致病因子，给全世界的养鸡业造成了相当大的经济损失。目前，球虫病的防控主要还是依赖于药物治疗和活疫苗的免疫预防。但是，由于长期广泛使用各种抗球虫药，艾美耳球虫对大多数市售的抗球虫药物产生了耐药性。此外，这些药物的残留引起了食品安全问题，而且活的抗球虫疫苗存在散毒、价格等问题。虽然亚单位疫苗的效果低于活疫苗，但相对而言更容易生产，也比较方便和安全。亚单位疫苗的免疫效果决定抗原的保护性，当前已经报道的抗原大多只能提供部分保护性，因此，寻找新的免疫保护性抗原迫在眉睫。迄今鉴定的免疫保护性抗原包括顶膜抗原1，折光体蛋白，微线体蛋白，延伸因子1α，热休克蛋白，表面抗原，免疫定位蛋白1，前纤维蛋白等。

柔嫩艾美耳球虫复杂的生活史决定了其入侵机制的复杂性，因此整个入侵过程涉及到的蛋白分子也就较多，这些分子有已知的还有未知的。含有锌指结构域的一类蛋白被称为锌指蛋白(ZnFPs)。ZnFPs通过锌指结构在DNA、RNA和蛋白质的识别和结合过程中发挥重要作用。有研究发现，在一些植物如水稻，拟南芥，小麦和棉花中，ZnFPs参与抗胁迫以及植物的生长发育。在分枝杆菌中，MsZnFP1和MsZnFP2通过与RNA聚合酶相互作用激活转录。在真核生物中，ZnFPs广泛表达并参与包括细胞分化，增殖和凋亡在内的重要生物过程。在弓形虫中，TgZNF2可能在mRNA核输出中起关键作用。E.tenella是引发鸡球虫病最重要球虫种类之一，属于具有复杂生命周期的顶复门，需要入侵鸡的肠上皮细胞维系自身的生长和发育。我们推测EtZnFPs可能参与了柔嫩艾美耳球虫生命活动中的某些重要生物过程。然而，迄今为止还没有关于EtAN1-ZnFP的研究。

发明内容

本发明对柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白(AN1-like Zinc finger domain-containing protein，putative partial mRNA，EtAN1-ZnFP)进行克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中表达了重组蛋白GST-EtAN1-ZnFP(rEtAN1-ZnFP)。用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体。通过间接免疫荧光检测EtAN1-ZnFP在虫体不同发育阶段的分布，并采用体外抑制实验评估抗EtAN1-ZnFP多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用。通过荧光定量PCR(qPCR)检测EtAN1-ZnFP在虫体不同发育阶段的转录水平，通过免疫保护实验评估rEtAN1-ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。本研究结果表明EtAN1-ZnFP可能参与了柔嫩艾美耳球虫的入侵和生长发育。

针对以上问题，本发明一方面提供一种cDNA分子，其序列如SEQ ID No：12所示。所述的cDNA分子编码柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白；

本发明的另一方面在于提供如SEQ ID No：11所示的柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白；

本发明的另一方面在于提供用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体，并提供这种抗体在对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用中的应用；

本发明的另一方面在于提供EtAN1-ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。

本发明的另一方面在于提供一种特异引物对，其可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有EtAN1-ZnFP中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；