[发明专利]一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用，所述引物组包括外引物和内引物，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述FIP为5端生物素标记的序列，所述BIP为5端异硫氰酸荧光素标记的序列。本发明结合环介导等温扩增技术与横向流动试纸条技术，针对FAdV‑4重要的因子52k基因设计一套引物，建立FAdV‑4的LAMP‑LFD快速检测技术，本发明提供的LAMP‑LFD试剂盒操作简便，安全可靠、灵敏高效、特异性好，特别适合于现场快速可视化检测。

技术领域

本发明属于禽腺病毒血清4型检测技术领域，具体涉及一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

禽腺病毒是腺病毒科腺病毒属的成员，根据限制性内切酶试验，禽腺病毒分为五个亚种(A-E)，根据血清交叉中和试验，它被分为12个血清型(1-8a，8b-11)。禽腺病毒是危害养禽类的病原之一，在养殖场中主要造成：禽肌胃糜烂(adenoviral gizzard erosion,AGE)、包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)、心包积液综合症(hydropericardiumsyndrome,HPS)等。在这些疾病中，主要由禽腺病毒血清4型(FAdV-4)导致的心包积液综合症死亡率达到10％-100％不等，易感染3-5周龄肉鸡，并且在心脏部位出现心包液聚集，肝炎，肾炎。在长期对中国禽腺病毒的监测发现，从2006年到2014年总是出现零星的禽腺病毒感染的情况，但并未造成大规模的爆发。自2015年中旬开始，中国多个地区规模化鸡场爆发了包涵体肝炎-心包积液综合症且呈现快速扩散的趋势，严重危害了家禽养殖业的发展。因此，急待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床病原微生物检验方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人在2000年发明的一种新的恒温核酸扩增技术。传统的PCR技术离不开反复升降温这个耗时耗能的过程，反应程序设定繁琐，且需要昂贵的仪器设备。相比之下，LAMP技术针对靶基因的6个区域设计特异引物，利用链置换DNA聚合酶在60-65℃的恒温水浴锅内作用30-60min，即可实现对靶基因的109-1010倍扩增，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，且不需要昂贵的仪器设备，反应结果观察方式可直接肉眼观察沉淀或添加荧光染料变色等，其成本远低于荧光定量PCR。因此，该技术具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果、反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点，特别适合病原微生物的检测。

监测LAMP反应的方法有观察白色沉淀、琼脂糖凝胶电泳(AGE)、添加SYBR Green或钙黄绿素进行可视化显色反应。然而，通过肉眼观察白色沉淀的生成有时是很模糊而不足以判断；用AGE或SYBR Green进行检测时要进行开盖步骤，有时会造成气溶胶污染而产生假阳性反应；而钙黄绿素加入反应体系中时会在某种程度上抑制LAMP扩增反应，进而降低反应灵敏度。横向流动试纸条(LFD)技术是一种新型、高效、准确检测LAMP产物的方法。该技术应用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物进行特异性的杂交，并与含有金纳米颗粒的抗FITC抗体进行结合形成三元复合物，结合在LFD的具有生物素配体的检测线上；未杂交的FITC标记探针与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。通过检测线是否显色来快速的进行判断结果。该检测技术避免了AGE或SYBR Green色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，也避免了钙黄绿素加入反应体系降低灵敏度，并进一步提高了反应的特异性和灵敏度，且反应迅速、操作简便安全。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用。