[发明专利]提高特异性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种提高反转录核酸链式扩增反应特异性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒；所述提高反转录核酸链式扩增反应特异性的方法包括有：在反转录反应阶段使用recA蛋白和ATP以保证反转录产物的特异性进而提高特异性；与现有技术相比反转录产物特异性明显提高，应用本发明方法获得的反转录产物在后续PCR反应中未见非特异性扩增；同时本发明中犬副流感病毒检测试剂盒采用氨基基团修饰引物和探针，提高了特异性，并缩短检测时间，最大限度保证诊断能力，方便临床使用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种提高反转录核酸链式扩增反应特异性和敏感性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒。

背景技术

反转录PCR(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被反转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于RNA病毒检测、遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(以下AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(以下 MMLV)反转录酶，由于反转录酶无修正错配活性，反转录产生的cDNA容易形成错配，导致后续的PCR反应特异性和敏感性降低。

recA蛋白首先与单链DNA结合，在ATP提供能量的条件下形成一条DNA－蛋白质细丝，活化的recA蛋白将双螺旋解旋和分离，同时企图将它结合的单链与被解旋区域退火，如此继续下去，直到找到互补顺序，一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继续驱使配对反应趋于完成，其方向是5’→3’，当新的杂交双链形成时，recA蛋白即从原来的单链掉下来。

我们在研究中发现在反转录反应中添加recA蛋白和ATP，可提高反转录产物的特异性，反转录产物经过测序确定无碱基错配。

犬副流感病毒感染犬的主要的呼吸道传染病。临床表现发热、咳嗽、流涕等症状，病理变化以卡他性鼻炎和支气管炎为特征，研究表明犬副流感病毒可引起急性脑髓炎和脑内积水，临床表现后躯麻癖和运动失调等症状，随着宠物数量的增加，犬副流感病毒检测试剂的需求也越来越大，对犬流感病毒核酸检测试剂的特异性和敏感性也提出了更高的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高反转录核酸链式扩增反应特异性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒，从而解决现有技术中反转录反应特异性差、RT-PCR非特异性扩增明显；犬副流感病毒检测试剂-包括核酸检测试剂特异性较差的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种提高反转录反应特异性和敏感性的反转录反应液，反应液中含有recA蛋白以及为recA蛋白提供能量的ATP。

第二方面，本发明提供一种提高反转录核酸链式扩增特异性和敏感性的 RT-PCR反应液，反应液添加反转录酶、taq酶、dNTP、特异性引物、缓冲液等常规成分以外，还添加了recA蛋白以及为recA蛋白提供能量的ATP。

第三方面，本发明提供一种用于检测犬副流感基因的引物对，包括有：在犬流感病毒基因保守序列设计的碱基序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示的引物；其中，所述碱基序列的5’端碱基具有氨基修饰基团，以提高引物Tm值。

第四方面，本发明提供一种用于检测犬副流感病毒基因的探针，包括有针对犬副流感病毒保守序列设计的碱基序列如SEQ ID No:3所示的荧光探针；其中，所述碱基序列中的一个碱基具有氨基修饰基团，提高了探针的Tm值。