[发明专利]一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法

权利要求书

1.一种提取黄瓜线粒体DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(一)黄瓜叶片组织破碎：

(1)摘取适量预冷的黄化苗叶片，放入1∶6稀释最终浓度1％的消毒液中清洗2分钟，之后置于冰水中清洗3遍；

(2)称取上述叶片组织20g置于组织破碎机，加入200mL匀浆缓冲液，同时加入0.28g半胱氨酸，在较低设置下匀浆3次，每次约5秒；

所述匀浆缓冲液为：甘露醇/蔗糖400mmol、EGTA 1mmol、MOPS-KOH 25mmol、甘氨酸10mmol、半胱氨酸/巯基乙醇8mmol、牛血清蛋白0.1％(W/V)、PVP 1％(W/V)；

(3)匀浆液用8层提前预冷无菌纱布和200目细胞筛依次过滤，并在冰上收集滤液，等量分装于4个无菌的50mL离心管中；

步骤(二)黄瓜叶片破碎组织匀浆滤液离心分离出线粒体：

提取之前，准备2个Corex离心管依次加入10mL80％Percoll和10mL33％Percoll液制成明显分层的密度梯度液，置于4℃冰箱备用；

(1)高速冷冻离心10min，离心力1000×g，细胞碎片于底部沉淀，收集上层清液；

(2)上层清液转至4个全新50mL离心管，2000×g离心10min，去除叶绿体等细胞器结构，收集上层清液；

(3)将4管含有线粒体的清液分别转至4个无菌预冷的50mL离心管，于17000×g离心20min，此时沉淀即为粗制的线粒体；

(4)去除上清液，向线粒体沉淀中加入0.5mL洗涤缓冲液，并用无菌软毛笔蘸取重新悬浮，将4管合并得到2mL线粒体悬浮液；

所述洗涤缓冲液为：甘露醇400mmol、EGTA 1mmol、MOPS-KOH 10mmol、牛血清蛋白0.1％(W/V)；

(5)线粒体悬浮液中加入500uL的100％Percoll溶液，制成2.5mL含丰富线粒体的20％Percoll溶液；

(6)用移液管将线粒体悬浮液贴壁转移至提前备好的Percoll梯度液，之后超速冷冻离心60min，离心力18000×g；

(7)线粒体会在80％和33％Percoll液之间形成一条层带，回收线粒体加入10mL洗涤缓冲液，再以18000×g离心20min即可得到纯化的线粒体；如需保存，适量添加洗涤缓冲液和5％甘油重新悬浮，储存于-20℃用于后续试验；

步骤(三)对分离的线粒体裂解提取纯化mtDNA：

(1)向所提线粒体沉淀中加入800μL3％CTAB重悬沉淀，并于65℃水浴1h；水浴冷却至室温加入等体积24∶1的氯仿-异戊醇，上下颠倒混匀于室温下静置10min，12000×g离心10min；

(2)收集上清液至新的离心管，同样加入800μL 24∶1的氯仿-异戊醇混匀，12000×g离心10min；

(3)上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃条件下静置沉淀1-3h；

(4)12000×g离心10min后即可得到浓缩线粒体DNA，弃上清液，加入70％乙醇洗涤3次，并在干净的工作台中干燥后重悬于适量无菌超纯水中，置于-20℃保存或立即进行检测；

步骤(四)对所得mtDNA进行定量和定性分析：

(1)线粒体完整性观察：吸取15μL线粒体溶液置于干净载玻片，再加入5μL健那绿染液，吸打混匀后盖上盖玻片，10min之后进行显微观察线粒体；

(2)mtDNA浓度及电泳条带检测：吸取1μL所提mtDNA溶液，利用紫外分光光度计检测其浓度和纯度；取2μLmtDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，与空白对照观察DNA分子大小和带型；

(3)mtDNA纯度检测：根据NCBI基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计线粒体基因、核基因、叶绿体基因特异性引物；以所提取的mtDNA为模板进行PCR扩增，进一步验证是否存在叶绿体基因组和核基因组的污染；50μLPCR反应体系包括：1μLmtDNA，1μL上游和下游引物，25μL 2×Taq Master Mix和22μLddH₂O₂；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20S；55℃退火20S；72℃延伸2min20S，33个循环；72℃延伸5min，4℃保存；在1％琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物，结合凝胶成像系统观察条带。