[发明专利]一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法

说明书

本发明公开了一种提取黄瓜线粒体及其DNA的方法，属于植物生物技术领域。以黄瓜黄化苗为材料，调整提取过程组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合percoll密度梯度离心分离得到线粒体，并使用3％CTAB裂解线粒体，后续用氯仿‑异戊醇抽提得到高质量mtDNA。最终所提取线粒体完整性好，纯化后mtDNA浓度为158ng·μL^‑1，每20g叶片可得7.9μg mtDNA。其中A260/A280约1.87，说明本方法提取分离得到的mtDNA纯度高。本发明首次建立一套适用于黄瓜mtDNA提取纯化的有效体系，对于其他物种构建mtDNA提取纯化体系具有参考意义。

一、技术领域

本发明涉及一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法，适用于黄瓜线粒体DNA分离纯化，属于植物生物技术领域。

二、背景技术

线粒体作为一种半自主性细胞器，是细胞能量代谢重要场所(Lane et al.，2010)，在植物生长发育和繁殖等过程中发挥重要作用(Cui et al.，2012)。线粒体基因组拥有自身独立的转录和翻译系统，同时受到细胞核基因的调控(张晓等，2011；苏爱国等，2011)。

黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国重要的蔬菜作物，其线粒体基因组高达1685kb(Andrew J et al.，2011)，数倍于其他植物的线粒体基因组。作为一个细胞内遗传物质表现出三种不同遗传方式的双子叶植物，黄瓜线粒体呈现独特的父系遗传(HAVEY M J etal.，1998；SHEN J et al.， 2013)，是线粒体遗传研究的绝佳体系。陈劲枫等人率先通过远缘杂交成功获得了野生酸黄瓜 (C.hystrix，2n＝2x＝24)和栽培黄瓜(C.sativus，2n＝2x＝14)的种间杂交黄瓜(Chen et al.，2000)，为研究甜瓜属种间杂交质体的遗传研究提供了良好材料。因此提取高质量黄瓜mtDNA是进行线粒体基因组功能分析，成为进一步开展黄瓜种间杂交核质互作、细胞器遗传进化等研究工作的关键。

然而，由于植物细胞中细胞壁、液泡和叶绿体的影响，使黄瓜线粒体的分离变得更加困难。另外，黄瓜基因组较大的原因主要是包含了大量的重复序列以及外源序列片段，包括核基因组序列、叶绿体基因组序列以及病毒细菌的序列，而并非包含更多的基因。因此，和其他作物相比，黄瓜mtDNA的提取难度更大，目前还没有关于黄瓜mtDNA提取方法的报道。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法，适用于黄瓜线粒体 DNA分离纯化。要想得到高纯度的mtDNA，需要除去核基因和叶绿体基因等污染。经过差速离心法可以去除核基因污染，但是无法将沉降系数差异小的叶绿体和线粒体分开。本发明结合不同植物mtDNA提取方法，调整组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合percoll 密度梯度离心分离得到线粒体，成功构建了黄瓜mtDNA提取纯化体系，并且成本低、操作简单，产物质量高，这为进一步研究黄瓜线粒体基因组的核质互作、遗传差异等科学问题奠定基础。

技术方案

本发明基于前期不断摸索提取过程的组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合 percoll密度梯度离心分离得到线粒体，现得到适用于黄瓜mtDNA提取纯化有效体系。具体实验内容如下：

1.叶片组织破碎：

(1)摘取适量预冷的黄化苗叶片，放入1∶6稀释最终浓度1％的消毒液中清洗2分钟，之后置于冰水中清洗3遍；

(2)称取上述组织20g置于组织破碎机(JJ-2，温州标诺仪器有限公司)，加入200mL组织匀浆缓冲液，同时加入0.28g半胱氨酸，在较低设置下匀浆3次，每次约5秒；

(3)匀浆液用8层提前预冷无菌纱布和200目细胞筛依次过滤，并在冰上收集滤液，等量分装于4个无菌的50mL离心管中；

2.线粒体的提取与分离：