[发明专利]检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法，包括：取含有中期因子反义寡核苷酸的待测猕猴血浆，向所述猕猴血浆中加入流感泰德作为内标液，再加入适量氨水溶液、苯酚/二氯甲烷混合液，然后依次进行涡流后离心，以便得到处理后血样；取所述血样的上清液并进行LC/MS/MS分析；绘制标准曲线，并根据标准曲线法对所述待测猕猴血浆中所述中期因子反义寡核苷酸的含量进行定量分析。该方法具有专属性高，并且准确度、精密度、回收率和样品冻融稳定性等参数均符合检测要求。

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体而言，本发明涉及检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法。

背景技术

直接利用外来核酸片段干预致病性RNA是非常重要的一大类基因治疗策略，在近40年里已发展出多种功能核酸作为这种基因治疗策略的候选结构，包括反义核酸、核酶、脱氧核酶、小干扰RNA(siRNA)和miRNA等。它们在抗肿瘤、抗感染、心血管系统疾病、神经系统疾病、代谢失调、炎症、免疫治疗，以及传统的小分子药物无法发挥治疗作用的疾病和罕见病等治疗中已显示出巨大的应用潜力。

对于很多疾病的致病基因，体外合成的核酸药物是一种不错的选择。随着分子生物学的发展，人们对疾病相关的基因网络调控和相关功能蛋白会有更多的了解，尤其是各种内源性核酸对于基因转录和表达的自有调控系统，有利于选择关键的致病基因作为基因治疗的靶标和合适的基因治疗方案，包括利用基因编辑技术实施置换或消除致病基因；利用反义核酸剪切或封闭其表达，或调控外显子跳跃和剪接，达到下调或上调功能蛋白表达的目的；采用siRNA和核酶方法降解靶RNA；针对miRNA网络来调控靶RNA的表达。所以，针对一种或一类疾病的相关基因突变，可以有多种候选方法，这是基因治疗的一大优点。处于临床前和临床试验中的核酸药物先后达到数百种之多，但因核酸结构离成药性要求相去甚远(极性大分子、带多个负电荷、易于被核酸酶降解和被肝肾清除、免疫原性和转运困难等)，在研发过程中遭遇了极大的挑战。而化学修饰在核酸药物的成药性优化策略中发挥了巨大作用，并已取得了相当大的成效。在经历了第1代、第2代和第2.5代的进步，获得的一个重要经验是一种化学修饰不可能解决所有问题，多个修饰的组合是最有效的解决途径，也是目前所有核酸药物所采取的修饰方式。当然，核酸药物的种类和作用机制对修饰的方式和位点的选择具有重要意义。

经过近40年的发展，从已成功用于临床治疗的反义药物到充满希望的siRNA药物，核酸药物在化学修饰、转运载体、序列依赖性和非依赖性的药学性质、体内外评价方法等方面积累了丰富的经验。为今后扩大基因治疗范围，开发更多核酸药物提供了理论基础和实践经验。因此，期待中国大力开展核酸药物的基础研究和应用开发，尤其是在核酸药物的创新性优化研究上，取得更多知识产权，在未来核酸基因药物的巨大应用市场研发中占有一席之地。

反义核酸类药物与内源性物质的相似性和分子质量大等特点。因此，反义核酸类药物药物代谢动力学研究方法和技术所面临的最大挑战是如何高效地从生物基质中萃取、富集和识别药物和避免内源性物质干扰，并准确鉴别和定量分析反义核酸类药物。目前，放射性同位素示踪技术、高效液相色谱、高效薄层色谱、毛细管电泳和质谱等用于反义核酸类药物的药物分析。但是对于生物基质(血、尿、粪便等)中的反义寡核苷酸的定量分析鲜有报道。仅用毛细管电泳检测方法报道，毛细管电泳法是包含电泳、色谱及其交叉内容。该方法特异性较差，灵敏度不高。为了克服以上局限性，必须发展替代性的生物基质中反义核酸类药物定量分析方法以满足对反义核酸类药物进行准确度高、特异性强、灵敏度高地生物基质样本中的定量分析的要求。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法，该方法具有专属性高，并且准确度、精密度、回收率和样品冻融稳定性等参数均符合检测要求。

根据本发明的一个方面，本发明提出了检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：