[发明专利]基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法

权利要求书

1.一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器的制备方法，其特征在于；包含以下步骤：

（1）用Al₂O₃抛光粉打磨直径为2mm的金电极至镜面，超纯水冲洗干净；

（2）取8μL、1μM的H2固定液滴加到电极表面，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（3）取8μL、2mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，盖上电极帽，室温孵育1.5h，封闭电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（4）取10μL含有目标miRNA和1μΜ H1的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得的电极上，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（5）取10μL含有四种辅助探针各1μΜ的杂交缓冲液滴加在步骤（4）所得的电极上，盖上电极帽，室温孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（6）将含有50μΜ六氨合钌的电化学检测液通氮气，20min；

（7）步骤（5）所得的电极置于步骤（6）所得的电化学检测液中，浸泡1h，使六氨合钌吸附在DNA双链上；

（8）步骤（7）所得的电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.1电势范围内用差分脉冲伏安法扫描；

步骤（4）所述H1序列为GGCGGCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTCCATGTGTAGATAGCTTATCA GACT；

步骤（2）H2序列为HS-(CH₂)₆-TCAGTGATAAGCTATCTACACATGGACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGT CCATGTGTAGA；

步骤（5）所述的四种辅助探针：

辅助探针1序列为ACTAAAAGGGTCTGAGGG TCTACACATGG ACATGG；

辅助探针1*序列为CCCTCAGACCCTTTTAGTCCATGT CCATGTGTAGA；

辅助探针2序列为GATGTTGAGCCGCCTACACCCCCACCTGC；

辅助探针2*序列为GGCGGCTCAACATCGCAGGTGGGGGTGTA；

目标miRNA序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；

步骤（1）的具体方法为；

将金电极置于新鲜配制的Piranha溶液浸泡30 min，Piranha溶液由浓硫酸与30wt.%双氧水按体积比3:1混合制得，随后用超纯水将金电极表面清洗干净；先后用0.3μm 和0.05 μm的氧化铝粉末将金电极表面抛光至镜面；将抛光后的金电极先后置于乙醇和超纯水中，分别超声清洗2 min，以彻底清除电极表面附着的氧化铝粉末；将金电极置于新鲜配制的0.5M H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位范围-0.6~0.1 V，扫速0.1 V/s，持续扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线，用超纯水再次冲洗已完成预处理的金电极，用氮气吹干电极；

所述H2固定液的制备：包含10 mM Tris-HCl 缓冲液， 1 mM EDTA，500 mM NaCl，10 mMTCEP，超纯水，调节pH= 7.4，1μM H2，在金属浴中加热至95℃，保持5min，避光缓慢降至室温，使H2形成发卡结构；

H1的杂交缓冲液的制备：包含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，500 mM NaCl， 1 mMMgCl₂，超纯水，调节pH =7.4，加入1μΜ H1、目标miRNA；

巯基己醇溶液的制备：取巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；

六氨合钌的电化学检测液为：50mM 六氨合钌，10mM Tris-HCl，pH 7 .4。

2.如权利要求1所述方法制备获得的电化学生物传感器。