[发明专利]基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法

说明书

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法。杂交链式反应（HCR）是检测低浓度miRNA的有效方法，然而当前的HCR仍然受到诸多问题影响，如有限的扩增效率，复杂的设计等问题。我们提供了一种靶标催化的无酶和无标记双尾杂交链反应(DtHCR)，用于生物样品中miRNA‑21的超灵敏检测。该方法包含两个部分：靶目标催化发卡组装，形成双尾杂交的主干部分，然后辅助探针杂交形成支链部分。该方法包含两步信号放大过程，能够由单个靶标引发组装大量双尾杂交链，从而提供定位活细胞中单个靶分子的潜力。

技术领域

本发明涉及生物传感技术领域，特别涉及基于催化发卡组装和杂交链式反应放大的电化学生物传感器。

背景技术

MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。例如，miRNA 在癌症的发生和发展过程中过表达，并且对治疗具有抗性。因此，miRNA可以作为预防，治疗，诊断癌症的潜在生物标志物和药物靶标。在活细胞中检测miRNA的数量对于了解miRNA的生物功能，识别癌细胞和评价药物效果有重要意义。然而，由于细胞中miRNA的数量极少和极其复杂的细胞环境，定性定量的检测miRNA仍然存在不少挑战。

到目前为止，科学家们提出了各种各样的分析方法来定性定量的检测miRNA，例如miRNA成像、聚合酶链式反应、滚环扩增、分子机器等等。这些方法或者通过扩增目标物，或者通过放大信号，均可对特定序列的目标miRNA进行超灵敏的检测。然而，miRNA在细胞中含量少，自身的碱基数量少，大量的同族RNA且易降解。因此，在使用上述方法时有一些无法克服的缺陷，例如灵敏度低、特异性低、需要复杂的精密仪器等。

其他的一些方法，比如等温扩增，可以有效的解决这些问题。根据信号扩增的机制，等温扩增可以主要分为两大类：核酸酶辅助反应和无酶反应。通常，核酸酶辅助的方法是通过不同的核酸酶引发，使目标循环回收，例如：核酸外切酶、核酸内切酶、聚合酶等等。由于酶对pH、温度等因素要求十分苛刻，故而无酶反应用于miRNA的扩增吸引了越来越多科学家的目光。对于无酶反应而言，具有代表性的为杂交链式反应(HCR)，催化发卡组装(CHA)和熵驱动催（使得动力学控制的DNA模块组装的编程成为可能）。这种等温无酶放大的明显优点是操作简单，检测迅速，高灵敏度，高特异性，低成本。因此，该方法十分适合高灵敏度的电化学传感器。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法和应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器制备方法，包含以下步骤：

（1）用Al₂O₃抛光粉打磨直径为2mm的金电极至镜面，超纯水冲洗干净；

（2）取8μL、1μM的H2固定液滴加到电极表面，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（3）取8μL、2mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，盖上电极帽，室温孵育1.5h，封闭电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（4）取10μL含有目标miRNA和1μΜ H1的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得的电极上，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干。

（5）取10μL含有四种辅助探针各1μΜ的杂交缓冲液滴加在步骤（4）所得的电极上，盖上电极帽，室温孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；

（6）将含有50μΜ六氨合钌的电化学检测液通氮气，20min；

（7）步骤（5）所得的电极置于步骤（6）所得的电化学检测液中，浸泡1h，使六氨合钌吸附在DNA双链上。