[发明专利]一种快速定量检测靶标DNA的方法

说明书

本发明公开了一种快速定量检测靶标DNA的方法，包括步骤一，变性：将取样待测样本中的细胞破碎，RNA降解，且使双链DNA变性为单链DNA，获得变性后的样本；步骤二，杂交：变性后pH值为碱性的样本与保存在pH值为3.5‑4.0的核酸保存液中的单链RNA探针混合，在65℃条件下根据碱基互补配对原则杂交45min形成DNA‑RNA杂合体；步骤三，捕获：将第一抗体固定在载体上，用第一抗体对DNA‑RNA杂合体在42℃条件下捕获60min；步骤四，检测：将DNA‑RNA杂合体在42℃条件下与保存于蛋白保存液中的碱性磷酸酶标记的第二抗体进行结合，反应30min后，洗涤；在室温避光条件下静置10min，检测相对光量子数，在3小时以内即可实现对靶标DNA的快速定量检测。本发明具有检测快速且定量，检测结果更为准确的优点。

技术领域

本发明涉及靶标DNA定量检测领域，更具体地说，它涉及一种快速定量检测靶标DNA的方法。

背景技术

靶标DNA的检测，对于判断样本中所携带的细菌或病毒的含量具有重大的意义。

传统的检测方法的操作步骤较多，容易导致检测所花费的时间较长，难以快速定量判断样本中的所携带的细菌或者病毒的DNA含量，且检测过程中涉及到靶标DNA的扩增，容易导致靶标DNA量受到影响，最终导致检测结果不够准确。

因此，一种具有快速且准确定量检测出靶标DNA的方法具有深远的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种快速定量检测靶标DNA的方法，其具有检测快速且定量，检测结果更为准确的优点。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种快速定量检测靶标DNA的方法，包括如下步骤：

步骤一，变性：将待检测样本的细胞破碎，使蛋白质变性、RNA降解，且使DNA变性分解为单链DNA，获得变性后的样本；

步骤二，杂交：将步骤一中获得的变性后的样本与保存在pH值为3.5-4.0的核酸保存液中的特异性的单链RNA探针混合，在pH值为7.0-7.4的范围内、温度为65℃的条件下杂交45min，使特异性的单链RNA探针与变性后样本中的单链DNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合体溶液；

步骤三，捕获：将第一抗体固定在载体上，再加入步骤二中获得的DNA-RNA杂合体溶液，在温度为42℃的条件下，用第一抗体对DNA-RNA杂合体溶液中的杂合体捕获60min，将液体移除；

步骤四，检测：将步骤三中获得的用第一抗体捕获的DNA-RNA杂合体与保存于蛋白保存液中的第二抗体在42℃进行反应30min后，洗涤，在室温避光条件下静置10min，进行检测；所述步骤二中，所述变性后的样本中的单链DNA与单链RNA探针形成DNA-RNA杂合体；所述步骤三中，第一抗体为特异性识别杂合体的物质，所述特异性识别杂合体的物质为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体、多克隆抗体或单克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种；

所述第二抗体上携带有标记物，所述标记物在出现受激发光激发反应而发射荧光，或金颗粒聚集而显色，或酶催化反应而发光或显色。

通过采用上述技术方案，步骤一中，将细胞破碎后，通过浓度为1.75mol/L、与待检测样本的体积比为1∶2的氢氧化钠溶液的作用，在65℃的条件下反应30min，可使蛋白质变性，同时使RNA降解，从而减少了蛋白质、RNA对后续检测造成影响。此外，氢氧化钠溶液还可使DNA的双螺旋结构被打开，变性分解为单链的DNA。本发明中，采用化学和物理方法相结合的方法，可达到高效降解RNA和使双链DNA变性成单链DNA的作用。