[发明专利]一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

权利要求书

1.一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，是由下列步骤得到的：

(1)黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因DMache获得：由化学合成法合成DMache，如SEQ IDNo.1所示；

引物设计F、R：

F：5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

R：5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

以合成的DMache为模板，用上述引物扩增目的基因；

(2)突变体构建：

设计以下引物，使用重叠延伸PCR获得突变体：

1-F：AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

1-R：AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA

2-F：TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT

2-R：CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC

3-F：GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG

3-R：ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA

4-F：TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT

4-R：ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

第一轮PCR：用引物1-F和1-R扩增出片段1、引物2-F、2-R扩增出片段2、引物3-F、3-R扩增出片段3、引物4-F、4-R扩增出片段4；

第二轮PCR：以1-F、2-R为引物将片段1和片段2连接，以3-F、4-R为引物将片段3和片段4连接，最后再以1-F、4-R为引物将两个片段连接到一起，使用片段纯化试剂盒将上述PCR产物纯化，获得突变体，如SEQ ID No.2所示；

(3)表面展示载体的构建及转化

(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得：

设计如下三组引物：

Cot b-F：5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATCAT

Cot g-：5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTTTT

Cot z-F：5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGAT

使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA，以此为模板，扩增三种芽孢衣壳蛋白基因；

(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切，纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体，分别转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取质粒，分别用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切，分别与用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切的突变体连接后，分别转化至大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取表面展示质粒备用；

(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中，30℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液按10％接种量接种于25mL新鲜的GM I中，在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h，按5％接种量接种于5mL GMII中，37℃、150rpm震荡培养90min，吸取1mL培养物，5000rpm室温离心5min，1/10体积上清液冲悬菌体，加入5μL表面展示质粒，混匀，37℃水浴1h，37℃培养4小时，涂在含有氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养；

(4)枯草芽孢杆菌的孢子化

在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内，加入0.5mL步骤(3)培养的菌液，37℃，180rpm培养72h，8000rpm离心10min收集沉淀。