[发明专利]一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶有效
申请号: | 201910437304.7 | 申请日: | 2019-05-23 |
公开(公告)号: | CN110218735B | 公开(公告)日: | 2022-05-10 |
发明(设计)人: | 吕绍武;王利武;葛丹阳;姜蒙蒙 | 申请(专利权)人: | 吉林大学 |
主分类号: | C12N15/75 | 分类号: | C12N15/75;C12N15/55;C12N15/10;C12N11/16;C12R1/125 |
代理公司: | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人: | 魏征骥 |
地址: | 130012 吉*** | 国省代码: | 吉林;22 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 固定 枯草 芽孢 杆菌 表面 重组 乙酰 胆碱酯酶 | ||
1.一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌,其特征在于,是由下列步骤得到的:
(1)黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因DMache获得:由化学合成法合成DMache,如SEQ IDNo.1所示;
引物设计F、R:
F:5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT
R:5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT
以合成的DMache为模板,用上述引物扩增目的基因;
(2)突变体构建:
设计以下引物,使用重叠延伸PCR获得突变体:
1-F:AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT
1-R:AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA
2-F:TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT
2-R:CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC
3-F:GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG
3-R:ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA
4-F:TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT
4-R:ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT
第一轮PCR:用引物1-F和1-R扩增出片段1、引物2-F、2-R扩增出片段2、引物3-F、3-R扩增出片段3、引物4-F、4-R扩增出片段4;
第二轮PCR:以1-F、2-R为引物将片段1和片段2连接,以3-F、4-R为引物将片段3和片段4连接,最后再以1-F、4-R为引物将两个片段连接到一起,使用片段纯化试剂盒将上述PCR产物纯化,获得突变体,如SEQ ID No.2所示;
(3)表面展示载体的构建及转化
(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得:
设计如下三组引物:
Cot b-F:5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT
Cot b-R:
5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATCAT
Cot g-:5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG
Cot g-R:
5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTTTT
Cot z-F:5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG
Cot z-R:
5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGAT
使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA,以此为模板,扩增三种芽孢衣壳蛋白基因;
(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切,纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体,分别转化至大肠杆菌中,在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子,分别提取质粒,分别用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切,分别与用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切的突变体连接后,分别转化至大肠杆菌DH5α中,在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子,分别提取表面展示质粒备用;
(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中,30℃、180rpm过夜培养,将过夜培养的菌液按10%接种量接种于25mL新鲜的GM I中,在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h,按5%接种量接种于5mL GMII中,37℃、150rpm震荡培养90min,吸取1mL培养物,5000rpm室温离心5min,1/10体积上清液冲悬菌体,加入5μL表面展示质粒,混匀,37℃水浴1h,37℃培养4小时,涂在含有氯霉素抗性的平板上,37℃过夜培养;
(4)枯草芽孢杆菌的孢子化
在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内,加入0.5mL步骤(3)培养的菌液,37℃,180rpm培养72h,8000rpm离心10min收集沉淀。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于吉林大学,未经吉林大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201910437304.7/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。