[发明专利]一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶有效

专利信息
申请号: 201910437304.7 申请日: 2019-05-23
公开(公告)号: CN110218735B 公开(公告)日: 2022-05-10
发明(设计)人: 吕绍武;王利武;葛丹阳;姜蒙蒙 申请(专利权)人: 吉林大学
主分类号: C12N15/75 分类号: C12N15/75;C12N15/55;C12N15/10;C12N11/16;C12R1/125
代理公司: 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 代理人: 魏征骥
地址: 130012 吉*** 国省代码: 吉林;22
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摘要:
搜索关键词: 一种 固定 枯草 芽孢 杆菌 表面 重组 乙酰 胆碱酯酶
【权利要求书】:

1.一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌,其特征在于,是由下列步骤得到的:

(1)黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因DMache获得:由化学合成法合成DMache,如SEQ IDNo.1所示;

引物设计F、R:

F:5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

R:5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

以合成的DMache为模板,用上述引物扩增目的基因;

(2)突变体构建:

设计以下引物,使用重叠延伸PCR获得突变体:

1-F:AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

1-R:AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA

2-F:TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT

2-R:CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC

3-F:GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG

3-R:ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA

4-F:TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT

4-R:ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

第一轮PCR:用引物1-F和1-R扩增出片段1、引物2-F、2-R扩增出片段2、引物3-F、3-R扩增出片段3、引物4-F、4-R扩增出片段4;

第二轮PCR:以1-F、2-R为引物将片段1和片段2连接,以3-F、4-R为引物将片段3和片段4连接,最后再以1-F、4-R为引物将两个片段连接到一起,使用片段纯化试剂盒将上述PCR产物纯化,获得突变体,如SEQ ID No.2所示;

(3)表面展示载体的构建及转化

(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得:

设计如下三组引物:

Cot b-F:5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R:

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATCAT

Cot g-:5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R:

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTTTT

Cot z-F:5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R:

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGAT

使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA,以此为模板,扩增三种芽孢衣壳蛋白基因;

(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切,纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体,分别转化至大肠杆菌中,在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子,分别提取质粒,分别用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切,分别与用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切的突变体连接后,分别转化至大肠杆菌DH5α中,在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子,分别提取表面展示质粒备用;

(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中,30℃、180rpm过夜培养,将过夜培养的菌液按10%接种量接种于25mL新鲜的GM I中,在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h,按5%接种量接种于5mL GMII中,37℃、150rpm震荡培养90min,吸取1mL培养物,5000rpm室温离心5min,1/10体积上清液冲悬菌体,加入5μL表面展示质粒,混匀,37℃水浴1h,37℃培养4小时,涂在含有氯霉素抗性的平板上,37℃过夜培养;

(4)枯草芽孢杆菌的孢子化

在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内,加入0.5mL步骤(3)培养的菌液,37℃,180rpm培养72h,8000rpm离心10min收集沉淀。

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