[发明专利]一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

说明书

本发明涉及一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶，属于分子生物学领域。设计筛选出突变位点并进行定点突变，然后以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot作为芽孢表面展示外源蛋白的一种蛋白载体，通过芽孢表面展示技术构建表面展示一种新型乙酰胆碱酯酶蛋白的重组芽孢。本发明通过分子对接及分子动力学模拟等技术，对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因进行定向化改造，突变后的AChE热稳定性显著增加，并将其固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面，可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效，利用枯草芽孢杆菌芽孢提高了重组AChE的稳定性，且枯草芽孢杆菌属于益生菌，对人体和环境不会造成影响，对提高其利用效率具有重要的意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的定点突变和枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot的应用。

背景技术

有机磷农药具有高效、广谱、对植物安全、价格低廉等特点，在我国被大量使用，直至21世纪初期，有机磷农药化学品几乎占到中国农药市场的70％。有机磷农药能够和乙酰胆碱酯酶(AChE)不可逆的结合，被世界卫生组织认定为对脊椎动物最具危险的杀虫剂之一，它广泛存在于环境中，并通过大气、水体、食物和生物富集等方式作用于人类。长期接触或食用含有有机磷农药残留物的物质，会造成慢性中毒，如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等。

在2010年至2018年之间，我国已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件，因此，对果蔬中的有机磷农药残留检测具有重要意义。国家标准中现行有效的测定各种食物中有机磷农药残留的方法是气相色谱法(GB 23200.93-2016等)、气相色谱-质谱连用法(GB 23200.97-2016等)以及快速检测的酶抑制法(GB/T18630-2002等)。其中气相色谱法和气相色谱-质谱连用法存在着分析周期长、分析过程繁琐、仪器价格昂贵、需要专业的操作人员等问题，不能应用于日常生活中，缺陷十分明显。酶抑制法是依据有机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中AChE的活性，根据AChE活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有超量的有机磷农药，酶抑制法主要包括速测卡和试剂盒两种。酶抑制法具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点，适合水果蔬菜上市前农药残留毒性的检测，受到基层疾病预防控制机构的普遍欢迎。

不同来源的AChE对有机磷类农药的灵敏度不同，昆虫体内AChE对有机磷农药的敏感性要高于其他生物，Schulze,H等对来自不同生物体的AChE对8种有机磷农药的双分子速率常数进行测定，来自果蝇的AChE的数值普遍大于其他来源的酶2-10倍，因此具有与农药更高的亲和力。但果蝇体积小，很难取头部提取AChE，无法满足市场的需要。家蝇和果蝇都是嗜温生物，其头部的酶不具有较好的热稳定性，在使用和运输的过程中容易受到反应环境、温度等因素的影响，降低了其准确性和重复性，这也制约了速测卡法测量的可靠性。

芽孢展示技术是一种新兴的生物固定化技术，可以把外源蛋白和芽孢衣壳蛋白融合在一起并组装成芽孢最外层的衣壳。即通过和芽孢衣壳蛋白共表达，最终把外源蛋白固定在芽孢表面，实现了使外源蛋白不需通过跨膜运输就能定位在芽孢表面。使外源蛋白具有更高的稳定性，这种稳定性包括对温度、pH值和有机试剂的耐受性。

对于果蝇乙酰胆碱酯酶获取困难问题，论文“重组黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶在甲醇酵母中表达的改善和基于此的新型农药残留快速检测传感器的改进”对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶进行密码子优化，以毕赤酵母作为宿主进行外源表达，成功得到了能够在培养液中表达718U/mL的酵母菌株，并应用于传感器当中。对一些农药检测灵敏度显著提高，如敌敌畏的检测限为0.04μg/L；克百威的检测限为0.1μg/L，远高于分光光度法的检测限10μg/L，但是其温度稳定性没有得到改善，在40℃时仅仅放置15min后就会导致13％的活性损失，30min后会导致20％的活性损失。