[发明专利]一种RFFT2细胞的构建方法

权利要求书

1.一种RFFT2细胞的构建方法，所述RFFT2细胞为用于细胞免疫治疗的T细胞，所述构建方法包括以下步骤：

S1）PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

其中，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；以突变的氨基酸位点为中心预测抗原表位，其中，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，以一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；采用多肽固相合成法合成突变多肽；

S2）冲击后扩大培养，得到FF细胞；

S3）以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4）培养PBMC细胞，在培养过程中，用步骤S3所得精准多肽进行3-4次多肽冲击；其中，所述精准多肽评判标准为：以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，检测值低的为低基线；两个基线的差异为系统误差；检测值高基线+系统误差的实验组即为有效的精准多肽；

S5）冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6）以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选能够识别所述精准多肽的特异性细胞；

S7）通过测序得到所述特异性细胞的TCR β链CDR3区序列，由所述TCR β链CDR3区序列扩增得到TCR基因；

S8）培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因，并转入步骤S7中所得能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，培养得到RFFT细胞；

S9）用单抗药对步骤S8所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，培养得到RFFT2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT或2B4（CD244）中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，

所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞或G422小鼠神经胶质瘤细胞。

3.根据权利要求1所述的用于细胞免疫治疗的RFFT2胞，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL~100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。

4.根据权利要求1所述的RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S8中，用敲除原有TCR的CRISPR慢病毒载体和敲除表面免疫抑制性信号分子的CRISPR慢病毒载体去感染PBMC细胞，同时进行原有TCR的敲除以及免疫抑制性信号分子的去除。