[发明专利]一种RFFT2细胞的构建方法

说明书

本发明提供了一种RFFT2细胞的构建方法，属于生物技术领域。该方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFFT2细胞，是一种攻防一体、精准性高、杀伤性高的T细胞。该构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激FF细胞以筛选精准多肽；培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多肽冲击；冲击后继续培养，得到RFF细胞；筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞；由特异性细胞获取TCR基因；培养PBMC细胞，敲除原有的TCR基因，并转入前述所获取的TCR基因，制备得到RFFT细胞；用单抗药对前述所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，得到RFFT2细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RFFT2细胞的构建方法。

背景技术

肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。

正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。

生物工程改造过的细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。

现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞，或者用病毒做为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。但要么由于肿瘤抗原不明和肿瘤微环境免疫抑制的障碍，致使效果不佳；要么由于让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因而导致效果不佳，要么靶点单一，只对个别肿瘤有效。

发明内容

本发明旨在提供一种RFFT2细胞的构建方法，构建一种新的TCR-T细胞(命名为RFFT2细胞)，用于细胞免疫治疗，实现了查杀的精准性、特异性和安全性。

本发明提供一种RFFT2细胞的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

其中，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；以突变的氨基酸位点为中心预测抗原表位；采用多肽固相合成法合成突变多肽；

S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞；

S7)通过测序得到特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；

S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因，并转入步骤S7中获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到RFFT细胞；