[发明专利]一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用在审
申请号: | 201910440489.7 | 申请日: | 2019-05-24 |
公开(公告)号: | CN110079530A | 公开(公告)日: | 2019-08-02 |
发明(设计)人: | 李和刚;张宁;赵金山;辛京京;秦怀远;郝小静 | 申请(专利权)人: | 青岛农业大学 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90 |
代理公司: | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人: | 吕纪涛 |
地址: | 266000 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 编辑工具 布氏乳杆菌 基因 靶标 质粒 制备方法和应用 表达载体 退火 单链寡核苷酸 双链DNA片段 基因位点 质粒共转 传统的 细胞 应用 | ||
1.一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具,其特征在于,包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒;
所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段;
所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段;
所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具识别的3’-端PAM序列为5’-NNAAAA-3’。
2.根据权利要求1所述的基因编辑工具,其特征在于,所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具,其特征在于,sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的基因编辑工具,其特征在于,所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO:3所示。
5.权利要求1~4任意一项所述的基因编辑工具的制备方法,包括以下步骤:
将编码LbCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LbCas9质粒;
将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间;步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。
7.权利要求1~4任意一项所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用,包括以下步骤:
1)确定待编辑基因的靶标序列,并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对;
2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段;
3)将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体;
4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36~60h。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述靶标序列的长度为15~25bp。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例为(1~5):(1~5)。
10.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接;所述酶切用酶为BbsⅠ酶。
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