[发明专利]一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用在审

专利信息
申请号: 201910440489.7 申请日: 2019-05-24
公开(公告)号: CN110079530A 公开(公告)日: 2019-08-02
发明(设计)人: 李和刚;张宁;赵金山;辛京京;秦怀远;郝小静 申请(专利权)人: 青岛农业大学
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90
代理公司: 北京高沃律师事务所 11569 代理人: 吕纪涛
地址: 266000 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 编辑工具 布氏乳杆菌 基因 靶标 质粒 制备方法和应用 表达载体 退火 单链寡核苷酸 双链DNA片段 基因位点 质粒共转 传统的 细胞 应用
【权利要求书】:

1.一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具,其特征在于,包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒;

所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段;

所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段;

所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具识别的3’-端PAM序列为5’-NNAAAA-3’。

2.根据权利要求1所述的基因编辑工具,其特征在于,所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具,其特征在于,sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的基因编辑工具,其特征在于,所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO:3所示。

5.权利要求1~4任意一项所述的基因编辑工具的制备方法,包括以下步骤:

将编码LbCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LbCas9质粒;

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。

6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间;步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

7.权利要求1~4任意一项所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用,包括以下步骤:

1)确定待编辑基因的靶标序列,并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对;

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段;

3)将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体;

4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36~60h。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述靶标序列的长度为15~25bp。

9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例为(1~5):(1~5)。

10.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接;所述酶切用酶为BbsⅠ酶。

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