[发明专利]一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，其特征在于，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；

所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；

所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段；

所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具识别的3’-端PAM序列为5’-NNAAAA-3’。

2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具，其特征在于，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。

5.权利要求1～4任意一项所述的基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

将编码LbCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LbCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间；步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

7.权利要求1～4任意一项所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；

3)将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；

4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述靶标序列的长度为15～25bp。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例为(1～5)：(1～5)。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。