[发明专利]一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用，属于基因编辑技术领域，所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具包括pcDNA3.1‑LbCas9质粒和pLbCas9‑sgRNA质粒。所述应用包括以下步骤：确定靶标序列，设计单链寡核苷酸对；退火获得双链DNA片段；连接到pLbCas9‑sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；靶标序列sgRNA表达载体与pcDNA3.1‑LbCas9质粒共转染细胞后培养。所述基因编辑工具所识别的3’‑端PAM序列是5’‑NNAAAA‑3’(不同于传统的5’‑NGG‑3’)，扩展了可以编辑的基因位点的范围。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其应用及其制备方法和应用。

背景技术

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对质粒和病毒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome EngineeringUsing CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genomeengineering viaCas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，spCas9存在较为明显的脱靶效应(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al,2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak etal,2013)。传统的CRISPR/Cas9系统识别的PAM序列是3’-NGG，这限制了它的应用范围。因此，有必要开发出识别新的PAM序列的CRISPR/Cas9系统。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种识别PAM序列为5’-NNAAAA-3’的源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；

所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；

所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。

优选的，所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。

本发明提供了所述的基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

将编码LbCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LbCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。