[发明专利]一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

(1)样本采集接收及细胞分离：

(1.1)采集新生胎儿脐带和母血：采集新生胎儿脐带，在距脐带两末端约2-3cm处结扎，然后将采集的所述新生胎儿脐带置于含有两性霉素B和庆大霉素储运液的脐带瓶中，连同母血一并放入4-25℃的保温箱中保存；

(1.2)将采集的所述新生胎儿脐带在22h内运达实验室；

(1.3)规范接收、登记，并签署知情同意书，对母血进行HBV、HCV、CMV、TP、HIV及ALT检测；

(1.4)用PBS反复冲洗所述新生胎儿脐带，去除外表皮血丝，洗出静脉中的残血；

(1.5)将所述新生胎儿脐带的一端固定在解剖台上，在距离固定处1cm处用解剖刀划一条深浅适度的环形口，用解剖镊撕掉脐带的外表皮，获得华通氏胶，并剥下所述新生胎儿脐带中两条动脉的外膜；

(1.6)在经过步骤(1.5)处理后的新生胎儿脐带中加入消化酶溶液进行消化反应，反应完成后加入完全培养基终止消化，获得细胞悬液；

(1.7)将所述细胞悬液先过100目筛网，再过200目筛网，之后1700rpm，离心7min，弃上清，沉淀加入完全培养基悬浮；

(2)原代细胞培养：将细胞接种于装有原代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，获得原代细胞；所述原代细胞培养液由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物为：Ultroser G血清替代物6-8％(v/v)、维生素80-100μg/mL、干细胞生长因子30-80ng/mL、氨基酸5-15mmol/mL、微量元素100-200mmol/L；

(3)传代培养：待原代细胞的融合度达到80％以上时，将原代细胞接种于装有传代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，获得传代细胞；所述传代细胞培养液由原代细胞培养液和传代添加物组成，所述传代添加物为：丝氨酸20-30μg/mL、甘氨酸20-40μg/mL、生物素3-5mmol/mL、叶酸2-5mmol/mL、吡多醇2-3mmol/mL、硫胺素1-2mmol/mL、B族维生素3-5mmol/mL；

(4)细胞检测：待传代细胞的融合度达到80％以上时，可以继续传代培养；之后选取生长良好的第三代细胞经抗体孵育洗涤后进行细胞活性检测、活细胞计数及细胞流式检测。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤(1.6)中所述消化酶溶液含1-2mg/mL胶原酶、4-6μg/mL透明质酸酶，消化过程为加入消化酶37℃消化，并每隔10min震荡1次，消化2h后，加入完全培养基终止消化，获得消化液；且所述消化酶溶液的配制方法是：先将60mg所述胶原酶用60mL的PBS溶解获得混合液，然后取40mL所述混合液加入200μL透明质酸酶，之后用0.22μm滤器过滤，获得所述消化酶溶液。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤(1.6)可以采用1-2mg/mL胶原酶和4-6μg/mL透明质酸酶的混合液1，37℃消化60min，之后0.25％胰酶和0.1％DNaseⅠ混合液2，37℃消化20min的方式，获得细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤(1.6)可以采用1-2mg/mL胶原酶37℃消化1.5h，之后0.25％胰酶37℃消化30min的方式，获得细胞悬液。

5.根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤(1.6)所述消化酶溶液中的胶原酶可以是胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅳ。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述维生素包括维生素C、维生素B2、维生素B12、维生素D，所述干细胞生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子，所述氨基酸包括谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，所述微量元素包括钙离子和镁离子。