[发明专利]一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：样本采集接收及细胞分离，原代细胞培养，传代培养，细胞检测。本发明的有益效果在于：本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，大大缩短了细胞培养周期，快速获得了大量纯度较高、状态良好的间充质干细胞；本发明的分离和培养方法除分离了华通胶外，还剥离了两条动脉的外膜，获得的hUC‑MSCs生长状态良好，获得的P1代细胞数可达3～12.5×10⁷，流式检测表面抗体CD44⁺CD105⁺可达(99.6±0.2)％，且具有良好的成脂、成骨分化能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)始源于中胚层，具有多向分化潜能，在各类组织和器官中分布较为广泛。由于MSCs较好的分化和自我更新潜能，在组织修复再生领域的研究中被用作主要的种子细胞之一。近些年，干细胞的临床价值举世瞩目，其中人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)因其来源较广泛、易采集、伦理争议较少、体外扩增能力强、分化潜能高、低致瘤性、免疫原性低等优点，在临床上具有非常广阔的应用。

现阶段，MSCs细胞疗法在神经退行性疾病、心脑血管疾病、糖尿病、脊髓损伤、心脏病等慢性病的治疗中取得了阶段性进展。hUC-MSCs的制备培养方法是Romanov等人于2003年首次从剥离的华通氏胶中获得而建立。目前，hUC-MSCs的制备分离方法主要为组织块贴壁法，此方法虽然具有生产成本低的优势，但是也存在细胞培养周期长，不适于大规模临床研究及应用需求的缺点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，此方法采用酶消化法制备细胞，大大缩短了细胞培养周期，可以快速获得大量纯度较高、状态良好的间充质干细胞，进而为组织修复和再生医学领域提供理想的种子细胞。

一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，包括以下步骤：

(1)样本采集接收及细胞分离：

(1.1)采集新生胎儿脐带和母血：采集新生胎儿脐带，在距脐带两末端约2-3cm处结扎，然后将采集的所述新生胎儿脐带置于含有两性霉素B和庆大霉素储运液的脐带瓶中，连同母血一并放入4-25℃的保温箱中保存；

(1.2)将采集的所述新生胎儿脐带在22h内运达实验室；

(1.3)规范接收、登记，并签署知情同意书，对母血进行HBV、HCV、CMV、TP、HIV及ALT检测；

(1.4)用PBS反复冲洗所述新生胎儿脐带，去除外表皮血丝，洗出静脉中的残血；

(1.5)将所述新生胎儿脐带的一端固定在解剖台上，在距离固定处1cm处用解剖刀划一条深浅适度的环形口，用解剖镊撕掉脐带的外表皮，获得华通氏胶，并剥下所述新生胎儿脐带中两条动脉的外膜；

(1.6)在经过步骤(1.5)处理后的新生胎儿脐带中加入消化酶溶液进行消化反应，反应完成后加入完全培养基终止消化，获得细胞悬液；

(1.7)将所述细胞悬液过100目筛网，再过200目筛网，之后1700rpm，离心7min，弃上清，沉淀加入完全培养基悬浮；