[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用有效
申请号: | 201910441516.2 | 申请日: | 2019-05-24 |
公开(公告)号: | CN110117621B | 公开(公告)日: | 2021-07-16 |
发明(设计)人: | 李和刚;张宁;赵金山;秦怀远;辛京京;郝小静 | 申请(专利权)人: | 青岛农业大学 |
主分类号: | C12N15/90 | 分类号: | C12N15/90;C12N15/85;C12N15/10 |
代理公司: | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人: | 瞿晓晶 |
地址: | 266000 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 碱基 编辑器 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种基因编辑效率在20%~30%之间的碱基编辑器,其特征在于,由pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒组成;
所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒由载体骨架pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段组成,所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段通过PstI和ApaI酶切插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的2365bp-5178bp区间;
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒由载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段组成;
所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列如SEQEDNO:3所示。
2.权利要求1所述的碱基编辑器的制备方法,包括以下步骤:
将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒;
将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒;
所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的PstI酶切位点和ApaI酶切位点之间;所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。
3.权利要求1所述的碱基编辑器在非疾病治疗相关基因的编辑中的应用,包括以下步骤:
1)确定待编辑基因的靶位点,并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对;
2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段;
3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体;
所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接;所述酶切用酶为BbsI酶;
4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36~60h。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤4)中靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例为0.5μg:(0.5~5)×106个。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的比例为(1~5):(1~5)。
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