[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用有效

专利信息
申请号: 201910441516.2 申请日: 2019-05-24
公开(公告)号: CN110117621B 公开(公告)日: 2021-07-16
发明(设计)人: 李和刚;张宁;赵金山;秦怀远;辛京京;郝小静 申请(专利权)人: 青岛农业大学
主分类号: C12N15/90 分类号: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/10
代理公司: 北京高沃律师事务所 11569 代理人: 瞿晓晶
地址: 266000 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 碱基 编辑器 及其 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种基因编辑效率在20%~30%之间的碱基编辑器,其特征在于,由pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒组成;

所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒由载体骨架pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段组成,所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段通过PstI和ApaI酶切插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的2365bp-5178bp区间;

所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒由载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段组成;

所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;

sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;

所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列如SEQEDNO:3所示。

2.权利要求1所述的碱基编辑器的制备方法,包括以下步骤:

将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒;

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒;

所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的PstI酶切位点和ApaI酶切位点之间;所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。

3.权利要求1所述的碱基编辑器在非疾病治疗相关基因的编辑中的应用,包括以下步骤:

1)确定待编辑基因的靶位点,并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对;

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段;

3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体;

所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接;所述酶切用酶为BbsI酶;

4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36~60h。

4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤4)中靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例为0.5μg:(0.5~5)×106个。

5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的比例为(1~5):(1~5)。

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