[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 201910441516.2 | 申请日： | 2019-05-24 |
| 公开（公告）号： | CN110117621B | 公开（公告）日： | 2021-07-16 |
| 发明（设计）人： | 李和刚;张宁;赵金山;秦怀远;辛京京;郝小静 | 申请（专利权）人： | 青岛农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/85;C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 瞿晓晶 |
| 地址： | 266000 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 碱基 编辑器 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种基因编辑效率在20％～30％之间的碱基编辑器，其特征在于，由pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒和pLbCpf1-sgRNA重组质粒组成；
所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒由载体骨架pCMV-dCpf1-eBE和dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段组成，所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段通过PstI和ApaI酶切插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的2365bp-5178bp区间；
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒由载体骨架pUC57和sgRNA通用表达框的DNA片段组成；
所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述pLbCpf1-sgRNA重组质粒的核苷酸序列如SEQEDNO：3所示。
2.权利要求1所述的碱基编辑器的制备方法，包括以下步骤：
将dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段插入到载体骨架pCMV-dCpf1-eBE中构建获得pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒；
将sgRNA通用表达框DNA片段插入到载体骨架pUC57中获得pLbCpf1-sgRNA重组质粒；
所述dCpf1-RR-eBE表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pCMV-dCpf1-eBE的PstI酶切位点和ApaI酶切位点之间；所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为载体骨架pUC57的EcoRV酶切位点。
3.权利要求1所述的碱基编辑器在非疾病治疗相关基因的编辑中的应用，包括以下步骤：
1)确定待编辑基因的靶位点，并根据所述靶位点设计所述靶位点的单链寡核苷酸对；
2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；
3)将所述双链DNA片段连接到pLbCpf1-sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；
所述双链DNA片段与pLbCpf1-sgRNA重组质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsI酶；
4)将所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒共转染细胞后培养36～60h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤4)中靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的总质量与转染细胞的个数的比例为0.5μg:(0.5～5)×106个。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶位点sgRNA表达载体与所述pCMV-dCpf1-RR-eBE重组质粒的比例为(1～5)：(1～5)。
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