[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种碱基编辑器及其制备方法和应用，属于基因编辑技术领域，所述碱基编辑器包括pCMV‑dCpf1‑RR‑eBE重组质粒和pLbCpf1‑sgRNA重组质粒；所述应用包括以下步骤：确定靶标序列，设计单链寡核苷酸对；退火获得双链DNA片段；连接到pLbCpf1‑sgRNA重组质粒中获得靶位点sgRNA表达载体；靶位点sgRNA表达载体与pCMV‑dCpf1‑RR‑eBE重组质粒共转染细胞后培养；本发明所述碱基编辑器能够特异性的将靶位点的胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，而对非靶位点的碱基没有任何影响，基因编辑效率在20％～30％之间。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种碱基编辑器及其制备方法和应用。

背景技术

传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然具有较高的基因敲除效率，但在执行碱基替换 (譬如对造成遗传性疾病的点突变进行矫正)时效率通常很低，这也限制了CRISPR/Cas9 基因编辑的应用。近年，利用将CRISPR/Cas9和APOBEC(胞嘧啶脱氨酶)整合而发展出的新型碱基编辑系统(Base Editor,BE)，可在单碱基水平(如胞嘧啶向胸腺嘧啶)实现高效率的基因组靶向编辑改造。这种新型碱基编辑系统理论上可对数百种引起人类疾病的基因组点突变进行定点矫正，因此拥有巨大的临床应用潜力。目前已报道的碱基编辑系统均是利用Cas9蛋白(主要是Streptococcus pyogenesCpf1,SpCpf1和StaphylococcusaureusCpf1,SaCpf1)执行与基因组的靶向性结合，而这种靶向性结合依赖于靶点旁侧的PAM(ProtospacerAdjacent Motif)序列。SpCas9和SaCas9蛋白所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C-rich)，因此利用已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集 (A/T-rich)区域进行高效的碱基编辑操作。

近日，上海科技大学和中科院的科研人员构建了一系列基于CRISPR/Cpf1蛋白的新型碱基编辑器(Cpf1-BE)(见文献:Base editing with a Cpf1–cytidine deaminasefusion， Xiaosa Li,Ying Wang,Yajing Liu,Bei Yang,Xiao Wang,Jia Wei,ZongyangLu,Yuxi Zhang, Jing Wu,Xingxu Huang,Li YangJia Chen.Nature Biotechnologyvolume 36,pages 324–327(2018))。由于Cpf1蛋白可识别富含腺嘌呤/胸腺嘧啶的PAM序列，这种基于Cpf1 的新型碱基编辑器实现了在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域的碱基编辑操作。在拓展编辑区域的同时，基于Cpf1的新型碱基编辑器所产生的编辑副产物也较低，因此具有更高的编辑精准度。这种基于Cpf1的新型碱基编辑器与现有的基于Cpf1的碱基编辑器可实现碱基编辑的有效互补，为碱基编辑系统在基础研究及未来临床领域的全面深入应用提供了新方法、拓展了新思路。但是这种碱基编辑器仅仅识别5’-TTTV的PAM序列，这种靶点在基因组中比较稀少，从而导致它的应用范围狭窄。CRISPR/Cpf1-RR突变体(见文献:Engineered Cpf1variants with altered PAM specificities.Linyi Gao,David B TCox,Winston X Yan,John C Manteiga,Martin W Schneider,Takashi Yamano,HiroshiNishimasu,Osamu Nureki,Nicola CrosettoFeng Zhang.Nature Biotechnology volume35,pages 789–792 (2017))将识别范围扩展到了5’-TYCV，这种靶点在基因组中相对较多，将 CRISPR/Cpf1-RR突变体改造成新型的碱基编辑器，将会显著扩展碱基编辑的靶标范围。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够特异性的将靶位点中靶位点的胞嘧啶C 突变为胸腺嘧啶T的碱基编辑器及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：