[发明专利]一种载体组合及其应用

说明书

本发明提供了一种载体组合及其应用，属于基因工程技术领域。所述载体组合包括pCpf1‑sgRNA和pY010‑RR；所述pCpf1‑sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述pY010‑RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010‑RR；所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的载体组合，可以识别48bp的靶标DNA序列并开展特异性切割，从而使得基因编辑的特异性大大提高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种载体组合及其应用。

背景技术

文献:Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-CasSystem.Zetsche B,Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Slaymaker IM,Makarova KS,Essletzbichler P,Volz SE,Joung J,van der Oost J,Regev A,Koonin EV,Zhang FCell.2015 Sep23.pii:S0092-8674(15)01200-3.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038)中记载了CRISPR/Cpf1双链断裂基因敲除技术。传统的CRISPR/Cpf1系统识别的PAM序列是5’-TTTV，这种靶点在基因组中比较稀少，从而导致它的应用范围狭窄。CRISPR/Cpf1-RR突变体将识别范围扩展到了3’-TYCV，这种靶点在基因组中相对较多，显著扩展了CRISPR/Cpf1基因敲除的靶标范围。

虽然CRISPR/Cpf1-RR突变体扩展了CRISPR/Cpf1基因敲除的靶标范围，但是由于它仅仅识别24nt左右的碱基，这就决定了它仍然会存在一定的潜在脱靶效应。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种载体组合和应用，采用本发明提供的载体组合在基因编辑时，可识别48nt的靶标DNA序列。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种载体组合，所述载体组合包括pCpf1-sgRNA和pY010-RR；

所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述pY010-RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR；

所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述pCpf1-sgRNA中的sgRNA表达框的序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述pCpf1-sgRNA的构建方法包括：将上述技术方案中的sgRNA表达框插入到pUC57载体中，得到pCpf1-sgRNA。

本发明还提供了上述技术方案所述的载体组合在在哺乳动物的基因编辑中的应用。

优选的，包括以下步骤：

1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链DNA寡核苷酸，将所述两对单链DNA寡核苷酸分别退火，得到两个双链DNA片段；

2)将所述步骤1)得到的两个双链DNA片段分别插入到上述技术方案所述的pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中，得到两个载体；

3)将所述步骤2)得到的两个载体与上述技术方案所述的pY010-RR共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因编辑。

优选的，所述步骤3)两个载体与pY010-RR的质量比为(1～5):(1～5):(1～5)。