[发明专利]一种表达shRNA的AAV辅助包装载体、构建筛选方法和应用

权利要求书

1.一种表达shRNA的AAV辅助包装载体，其结构如图1所示，其是在Rep2与CapDJ辅助包装载体中CMV启动子驱动下的miR33-5’UTR和miR33-3’UTR之间插入克隆shRNA的位点2xBsmBI，将shRNA表达小片段连接入骨架载体的2xBsmBI位点，并以合成的pA终止子终止转录，其中miR33-5’UTR的序列如SEQ ID NO:1所示，miR33-3’UTR的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的表达shRNA的AAV辅助包装载体的构建方法，其特征在于，其步骤包括：

(1)制备线性化粘性末端的克隆用骨架；

(2)合成双链带粘末端的shRNA表达小片段；

(3)将步骤(2)中双链带粘末端的shRNA表达小片段连接至步骤(1)中克隆用骨架上。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述表达shRNA的载体的构建方法，具体步骤包括：

(1)用上述含有CMV-miR33-5’UTR-2xBsmBI-3’UTR表达盒的Rep/CapDJ辅助包装载体作为shRNA表达克隆骨架载体，命名为mRRC，使用BsmBI酶切得到线性化粘性末端的克隆用载体骨架；

(2)合成所需的shRNA的正反链引物，分别配成20μM浓度，按体积比正链：反链：10xT4DNA：灭菌无核酸酶H₂O＝1:1:1:7的配比取正链引物、反链引物加入10xT4 DNA连接反应缓冲液，并在灭菌无核酸酶H₂O内混匀，95℃变性5分钟后，以每分钟5℃的降温速度退火至常温，得到双链带粘末端的shRNA表达小片段；

(3)将步骤(2)中所得的双链带粘末端的shRNA表达小片段连接到步骤(1)中所得的线性化的骨架载体的2xBsmBI位点：把退火产生的双链带粘末端的shRNA表达小片段稀释20倍后，取1μl，再加入25ng mRRC载体骨架、1μl10xT4DNA连接酶反应缓冲液、0.5μlT4 DNA连接酶，用水补充到10μl总体积，16℃下连接16小时；后加1.5μlNEBuffer4(10X)反应缓冲液、1.5μl10mmol/lATP、0.5μlExonuclease V，37℃反应0.5小时，即得表达shRNA的AAV辅助包装载体。

4.一种权利要求1所述的表达shRNA的AAV辅助包装载体的筛选方法，其步骤包括：

(1)准备权利要求1所述的载体，或者按权利要求2-4任意一项所述方法骤构建连接表达shRNA的AAV辅助包装载体；

(2)转化：用(1)中所述载体转化Stbl3感受态细菌，培养，取培养菌液作无内毒素小量质粒提取；

(3)转染：将(2)中小量提取的质粒与Ad辅助质粒pAd-deltaF6、带ITR目的载体pITR-CAG..Gluc共转染293T细胞，设未插入shRNA的空载体作为对照样品，培养；

(4)滴度比较筛选：整板细胞进行冻融，离心，取上清作悬浮感染；然后检测Gluc酶活性强度，与对照相比量化倍数；确定能提高AAV产量的克隆，保存；后用保存的克隆菌种作平板划线培养，挑克隆菌测序确定shRNA序列。