[发明专利]一种表达shRNA的AAV辅助包装载体、构建筛选方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达shRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用；所述载体基于Rep2与CapDJ辅助包装载体，在CMV启动子驱动下的miR33‑5’UTR和miR33‑3’UTR之间插入克隆shRNA的位点2×BsmBI，shRNA表达小片段连接入所述骨架载体的2xBsmBI位点。所述载体的构建方法包括：制备克隆用骨架；制备shRNA表达小片段；将shRNA表达小片段连接至克隆用骨架载体上。所述筛选方法包括：用所述载体转化Stbl3感受态细菌，质粒提取；将提取的质粒共转染293T细胞；滴度比较筛选。本发明实现提高AAV生产效率约60％以上。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达shRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用。

背景技术

目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键，但必须要满足安全性、有效性、特异性的要求。基因病毒载体在基因治疗中发挥着关键的作用，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。但长期以来由于AAV的生产得率提升缓慢，严重制约着AAV载体在临床应用上的普及程度。

随着第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市，AAV作为基因治疗载体的可行性已被证明，但AAV的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。通常情况下，一个需要全身性转导的遗传疾病需要AAV约1x10¹⁵AAV基因组拷贝数(GC)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得1x10¹³GC的生产效率来计算，则需要生产100次或100倍的生产规模才能得到治疗一个病人的总量。因此，如何提高AAV的产量进而降低临床费用成为本领域技术人员亟待打破的瓶颈。

目前AAV的主要生产方法是三质粒转染293T细胞方法。该方法简单快速，但由于293T为贴壁细胞，其在规模上的扩展困难较大。若能能把贴壁细胞驯化为悬浮细胞，则该方法会成为规模化工业生产的重要候选方案。把贴壁的293T细胞驯化为悬浮细胞近几年已有人取得成功，但由于生产效率仍不能满足需求，规模化生产只能靠单一地增加生产规模。因此，在方法上改进、创新，取得更高的AAV产率是目前基因治疗的热点之一。

293细胞作为AAV生产所用的主要宿主细胞，并非天然适合AAV的生产。细胞中的信号通路及各AAV相关的关键基因表达和调节也存在很大的优化空间，如Stifani S.等人在2017年所揭示的，某些基因的下调表达可极大促进AAV包装的效率。因此，高效地筛选发现何种基因的下调表达能促进AAV的表达是一个提高AAV产率的重要的手段。在选择shRNA表达的方式上，最早期的方式是用Pol III启动子U6或H1来驱动shRNA的表达，但自2006年始，有报道证明使用Pol II启动子来驱动表达miRNA骨架上的shRNA更优，比常规的Pol III启动子驱动shRNA有更高的效率和更低的细胞毒性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种表达shRNA的载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用，所述载体用作shRNA的表达，可以大幅度提高AAV生产效率；所述构建方法、筛选平台在各环节实现高通量处理，省去各个载体单独克隆及测序验证的步骤，从而在得到有效筛选结果的基础上节省大量资源与人力。

本发明通过以下技术方案实现：

一种表达shRNA的AAV辅助包装载体，其结构如图1所示，其是在Rep2与CapDJ辅助包装载体中CMV启动子驱动下的miR33-5’UTR和miR33-3’UTR之间插入克隆shRNA的位点2xBsmBI，将shRNA表达小片段连接入骨架载体的2xBsmBI位点，并以合成的pA终止子终止转录，其中miR33-5’UTR的序列如SEQ ID NO:1所示，miR33-3’UTR的序列如SEQ ID NO:2所示。