[发明专利]一种用于造血干细胞体外扩增的培养体系及方法

说明书

本发明公开了一种用于造血干细胞体外扩增的培养体系，所述培养体系包括基础培养基、间充质干细胞条件培养基和细胞因子组合，其中细胞因子组合的浓度为SCF 50ng/mL、TPO 25ng/mL、IL‑6 20ng/mL和FLT3 50ng/mL；间充质干细胞条件培养基为总培养体系体积的50％。采用本发明培养体系培养的造血干细胞，一方面使HSCs在体外获得了大量的扩增，另一方面维持了HSCs的干性和稳定性，抑制其分化，维持其功能，使造血细胞的扩增倍数明显增高，且造血干细胞比例明显增高。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于造血干细胞体外扩增的培养体系及方法。

背景技术

造血干细胞移植目前在临床上应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、某些实体瘤及免疫系统疾病和遗产性疾病等的治疗，并具有较好的疗效。目前临床上获得造血干细胞(HSCs)的途径主要有3种：外周血动员、新生儿脐带血及骨髓来源。然而，临床仍然常常因为HSCs的来源有限而限制了该技术的广泛应用。外周血中HSCs的含量极少(不足0.1％)，且临床上常常由于动员效果不佳或实际含有的HSCs数量少而导致移植失败；单份脐带血所含的HSCs的数量不足，不能满足成年人及较大儿童的需要；骨髓采集由于创伤大且采集量有限已基本被淘汰。因此，研究者们正在积极地探索体外扩增造血干细胞的新方法。

造血干细胞体外扩增技术的研究从几十年前便开始进行，优化方案主要集中在调控HSCs自我更新和复制能力的内在因素(激活或抑制与自我更新相关的信号通路分子)和外在因素(体外培养环境中添加细胞因子、小分化合物、滋养层细胞共培养等)两类。具体而言，即研究者利用逆转录病毒载体使HSCs高表达某个基因，或将间充质干细胞(MSCs)作为饲养层与HSCs共培养，或在HSCs的培养液中添加组合的细胞因子或小分子化合物来促进HSCs在体外的生长和增殖。这些方法均使HSCs在体外获得了较好的扩增效率，扩增倍数能达到几十倍甚至上百倍。然而，病毒载体的毒性作用以及基因的整合对HSCs的稳定性和生物学特性存在潜在的影响，导致临床应用存在安全隐患；饲养层细胞的掺入影响HSCs的纯度并增加免疫排斥的风险；细胞因子组合方案虽有较高的扩增效率，但扩增所得的HSCs往往失掉了长期造血和重建免疫的功能。因此，需要寻找一种新的造血干细胞体外扩增培养方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种用于造血干细胞体外扩增的培养体系及方法，一方面使HSCs在体外获得了大量的扩增，另一方面维持了HSCs的干性和稳定性，抑制其分化，维持其功能。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种用于造血干细胞体外扩增的培养体系，所述培养体系包括基础培养基、间充质干细胞条件培养基和细胞因子组合。

优选的，所述基础培养基为含10％FBS的IMDM。

优选的，所述细胞因子组合的浓度为SCF 50ng/mL、TPO 25ng/mL、IL-6 20ng/mL和FLT3 50ng/mL。

优选的，所述间充质干细胞条件培养基为总培养体系体积的50％。

优选的，所述间充质干细胞条件培养基通过如下方法制备所得：

(1)将间充质干细胞用含10％FBS的α-MEM培养基重悬，以5×10⁴/mL的密度接种到T25培养瓶中；

(2)待细胞融合达到70％-80％时，更换培养液为无血清培养液；继续培养48小时，收集培养液，用0.22微米过滤器过滤除菌，-20℃冻存备用，得间充质干细胞条件培养基。

优选的，所述间充质干细胞为脐带、胎盘、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞的任意一种。