[发明专利]纳米金标记与液质联用定量人血清中的转铁蛋白的方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，涉及纳米金标记与液相色谱质谱联用技术定量人血清中的转铁蛋白的方法，具体涉及基于纳米金标记通过高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子质谱(ICP‑MS)联用来定量检测人血清中转铁蛋白的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)纳米金颗粒的制备；(2)纳米金标记人血清蛋白中的转铁蛋白；(3)HPLC‑ICP‑MS测量血清中转铁蛋白。本发明的方法成功的应用于人血清样品中转铁蛋白的检测，回收率在93.0‑99.7％之间。由于HPLC的高效分离和ICP‑MS的超灵敏检测，此方法具有同时测定生物样品中多种低丰度标志物的潜力。

技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，涉及纳米金标记与液相色谱质谱联用技术定量人血清中的转铁蛋白的方法，具体涉及基于纳米金标记通过高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子质谱(ICP-MS)联用来定量检测人血清中转铁蛋白的方法。

背景技术：

血清转铁蛋白是一种重要的β球蛋白，通过将铁从血浆中结合并转运至细胞来调节生物体内的铁离子平衡。此外，它还可以作为抑菌剂，一种重要的急性期蛋白，在急性期反应时会逐渐减少，并且在慢性肝病和营养不良中也会下降，因此可以用作营养状况的指标。也可用于诊断和监测许多疾病的治疗，如贫血，炎症和冠心病。

蛋白质的准确定量在生物学研究中具有重要意义，可以为蛋白质生理功能和疾病病理机制的研究提供重要信息。常规蛋白质定量方法包括放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定 (ELISA)，电化学发光免疫测定(ECLIA)和时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)。但这些方法在免疫反应中易受所用抗体的影响而导致不同的结果，且基于免疫反应的定量分析并不具备溯源性。为了保证临床检验结果的准确性和有效性，欧盟体外诊断器械指令(IVD指令) 及ISO17511等法规要求所有体外诊断产品的校准物、控制物及相关测量程序具有计量溯源性。因此，迫切需要建立准确、可溯源的人血清中Tf测量的新参考方法。

电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，由于其高灵敏度，稳定性，宽响应范围，低检出限和可以多元素同时检测的优点，在生命科学领域得到越来越广泛的应用。近年来，基于ICP-MS的蛋白质定量分析技术已成为蛋白质组学研究中的一种强有力的工具。在该技术中，所有肽或蛋白质等待测物在引入ICP-MS之前必须分离，之后，待测物的绝对定量可以通过定量ICP-MS可检测的，天然存在于待测物中的元素来实现，例如硫，磷，硒和金属(如铜，锌和铁)。然而，通过ICP-MS检测天然存在于蛋白质中的元素来定量蛋白质的应用是有限的，只有当蛋白质已被鉴定或已知蛋白质的结构和化学计量时，才可用于蛋白质的定量，这是蛋白质定量的一个难点。更重要的是，许多蛋白质并不含有ICP-MS可检测的元素，而且在实际的生物样品中，目标蛋白质的浓度大都非常低，对于这种痕量蛋白质的检测很困难。近些年，ICP-MS结合元素标签，特别是外源标签，已广泛用于各种样品中蛋白质的定量，如谷物，果树，血清和细胞质等。与传统的蛋白质定量方法相比，该方法具有许多优点：(1)可以通过ICP-MS直接分析标记在蛋白质上的元素，实现绝对定量；(2)通常选择样品中浓度很低的元素作为标签，因此背景干扰小；(3)ICP-MS的线性检测范围宽，适用于不同含量水平蛋白质的分析；(4)与放射免疫分析或化学发光相比，ICP-MS的灵敏度更高，且这种方法具有溯源性。许多元素标签可适用于蛋白质标记，包括金属纳米颗粒，同位素编码亲和标签(ICAT) 和载有不同镧系元素的金属螯合标签(MECT)等。纳米金(AuNPs)，由于其具有良好的生物相容性，表面区域可以固定如氨基酸，蛋白质，酶，和DNA等生物分子，因此生物分析领域受到广泛关注，已越来越多地应用于生物检测。

现有技术中没有纳米金标记与HPLC-ICP-MS联用定量人血清中的转铁蛋白的方法。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一种纳米金标记与液相色谱质谱联用定量人血清中的转铁蛋白的方法，是基于纳米金标记通过高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子质谱 (SEC-ICP-MS)联用来定量人血清中的转铁蛋白。此方法简单、灵敏、准确且直接溯源到SI国际单位。