[发明专利]一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法

权利要求书

1.一种去除死肝细胞的分离液，其特征在于，是在William’s E培养基中添加以下成分1% v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1%v/v的青链霉素、5%v/v的胎牛血清和0.3g/mL的Nycodenz；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。

2.一种利用权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞

取新鲜的肝组织，所述肝组织来源于大鼠，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得；所述灌注溶液II是在William’s E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/L Ⅳ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配；

步骤2：消化终止与细胞分散

将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心；

步骤3：细胞洗液清洗

将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；

步骤4：细胞活力的检测

取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4% m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力；

步骤5：原代肝细胞活细胞纯化

选取细胞活力小于80%的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。

3.根据权利要求2所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤2中，所述细胞筛的孔径为70μm；所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1%v/v青链霉素和5%v/v-10%v/v胎牛血清；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。

4.根据权利要求2所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤5中，所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1%v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1%v/v的青链霉素和5%v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为300g-800g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为50g-300g，温度为4℃，时间为5min。