[发明专利]一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法

说明书

本发明公开了一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，属于肝细胞分离与纯化技术领域。该分离液是在William’sE培养基中添加以下成分：0.1％v/v‑1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L‑2.5mmol/L的L‑谷氨酰胺、1μg/L‑20μg/L的表皮生长因子、15mg/L‑20mg/L的氢化可的松、35μg/L‑45μg/L的地塞米松、0.5％v/v‑1％v/v的青链霉素、1％v/v‑10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL‑0.5g/mL的Nycodenz。本发明具有维持肝细胞正常渗透压、修复部分受损肝细胞和为肝细胞提供营养需求的优点。

技术领域

本发明涉及一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，属于肝细胞分离与纯化技术领域。

背景技术

原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可广泛用于基础研究与药物研发，包括肝脏研究、肝炎病毒研究，药物代谢及毒性研究。然而，分离原代肝细胞时，细胞活力受多种条件影响，包括肝组织新鲜程度、灌注时间、灌注溶液组成等，存在较大的批次差异。现有技术分离的原代肝细胞的细胞活力为45％-95％，这严重影响了基于原代肝细胞的实验研究及药物研发。

目前，去除死肝细胞的常规方法有两种，具体如下：

第一种方法，低速离心法。该方法的原理是基于活肝细胞与死细胞、细胞碎片的质量与密度不同，通过低速离心(约离心加速度50g)，活肝细胞以沉淀形式与上清中的细胞碎片和死细胞分离开。上述方法是肝细胞分离过程中常规的步骤，可以去除一部分的细胞渣和少量的死细胞，但是此方法去除效果有限而造成肝细胞活力偏低。

第二种方法，利用离心介质——Percoll或Ficoll400，将细胞悬液加到Percoll或Ficoll400之上，通过离心力，将活细胞沉降到梯度底部，死细胞留在介质之上。上述方法的原理是：只有活细胞有穿过介质的能力，然而死细胞会在样品与介质之间形成死细胞层，阻止活细胞的穿过。对于细胞量大、细胞活率低的样品，该方法去除死肝细胞的效率相对低。

鉴于此，有必要提供一种新的去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种去除死肝细胞的分离液。本发明的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、地塞米松、青链霉素、胎牛血清和Nycodenz，具有维持肝细胞正常渗透压、修复部分受损肝细胞、为肝细胞提供营养需求的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：0.1％v/v-1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、1μg/L-20μg/L的表皮生长因子、15mg/L-20mg/L的氢化可的松、35μg/L-45μg/L的地塞米松、0.5％v/v-1％v/v的青链霉素、1％v/v-10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL-0.5g/mL的Nycodenz。

本发明的各个原料介绍：

1、William’s E培养基，即威廉姆斯E培养基。现有技术中，William’s E培养基，主要用于肝细胞的长期细胞培养与分化状态维持。在本发明中，William’s E培养基作为基础培养基。

上述William’s E培养基可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为12551032；或者购自美国Sigma公司，货号为W1878；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-WE001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。

2、ITS通用型培养添加剂