[发明专利]一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法

权利要求书

1.一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆，得到蛋液样品；

S2.将所述蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理，以降解所述蛋液样品中的蛋白成分和脂肪成分，得到处理后的蛋液样品；

S3.将所述处理后的蛋液样品进行膜过滤，得到过滤后的蛋液样品，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5～10μm；

S4.将所述过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到蛋液悬浮液；

S5.使用致病菌特异性探针对所述蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记，得到检测上样悬浮液；

S6.使用高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光进行检测，并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中，所述匀浆的条件包括：温度为4～37℃，转速为10～300rpm，时间为5～60min。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述稀释所采用的稀释剂为磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；相对于0.1mL的所述蛋液样品，所述稀释剂的用量为1～1000μL；

所述蛋白降解处理使用蛋白酶进行，所述蛋白酶为蛋白酶K、胰蛋白酶和弹性蛋白酶中的至少一种，所述蛋白酶的终浓度为0.1～10mg/mL；所述蛋白降解处理的条件包括：温度为10～50℃，时间为5～30min；所述去脂处理使用的去脂试剂为Triton X-100、Nonidet P 40或TWEEN-20，所述去脂试剂的终浓度为0.1～10体积％；所述去脂处理的条件包括：温度为0～50℃，时间为5～30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，所述离心的时间为1～30min，转速为1000～10000rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5中，所述致病菌特异性探针为标记了荧光染料的特异性抗体探针、标记了荧光染料的特异性适配子探针或标记了荧光染料的抗菌肽，所述荧光染料为有机染料、量子点或荧光蛋白；所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～120min；

所述核酸染料为EB染料、PI染料、TOTO系列染料、TO-PRO系列染料、SYTOX系列染料、SYTO系列染料、SYBR系列染料、DAPI染料或Hoechst染料；所述第二荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～60min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5中，以0.1mL的所述蛋液悬浮液为基准，所述致病菌特异性探针用量为0.01～100μg，所述核酸染料的浓度为0.1～100μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S6中，使用高灵敏流式细胞术如纳米流式检测仪对所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光和荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。