[发明专利]一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法

说明书

本公开涉及一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，该方法包括以下步骤：S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆；S2.将蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理；S3.将处理后的蛋液样品进行膜过滤；S4.将过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮；S5.使用致病菌特异性探针对蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记；S6.使用高灵敏度流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光进行检测；该方法适用于各种食用生蛋及液蛋样品的检测，可对样品中的目标致病菌和总菌数进行同时定量检测，包括各种致病菌、非致病菌等。

技术领域

本公开涉及食品卫生领域，具体地，涉及一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法。

背景技术

鸡蛋因其含有蛋白质、脂肪、微量元素等丰富的营养物质，且其价格低廉、生物利用率高、含有植物类蛋白均缺乏的色氨酸，而成为消费者不可或缺的食物，也因此被成为“完美食物”。

然而，鸡蛋在生产、贮藏及销售等环节容易受到细菌的污染，污染菌包括非致病菌及致病菌两大类。受非致病菌污染的鸡蛋一般不会直接引起人体疾病，但是，鸡蛋的营养价值、加工价值及贮存时间都会降低。因此，鸡蛋中细菌总菌数量成为衡量鸡蛋质量的一个标准。受致病菌污染的鸡蛋则会严重影响人体健康甚至危及生命。目前为止，大多数与鸡蛋相关的疫情都归因于沙门氏菌属，尤其以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌最为常见。沙门氏菌病是一种流行的全球食源性传染病疾病，感染者主要表现为轻度至中度肠胃炎，包括腹泻、腹部绞痛、呕吐等。据美国疾病中心统计，在美国，沙门氏菌每年导致120万人患病，23000人住院，450人死亡。鉴于鸡蛋的食用量较大，通过同时定量检测鸡蛋中致病菌和非致病菌含量以确保鸡蛋安全性及质量尤为重要。

在食品工业中，平板计数法是检测食品中细菌含量的“金标”方法。但是，该方法操作繁琐、耗时；另外，食品中的一部分细菌处于“存活但不能培养”或者难培养的状态，使得平板计数法受到很大局限；再者，当使用平板计数法检测致病菌含量时，操作步骤需包括使用显色培养基、生化实验、血清学鉴定等，进一步限制了平板计数法使用范围。需要我们注意的是，平板计数法无法实现在同一次试验中完成对致病菌和非致病菌的同时检测。综上，平板计数法难以满足快速、高通量、致病菌和非致病菌同时定量分析的要求。近些年，大量文献报道了食品中细菌快速检测的方法。这些方法包括：1)ATP生物荧光法、分光光度法及电阻抗法等方法可实现广谱细菌的定量检测，然而，该类方法无法同时对特异性致病菌和非致病菌进行检测；2)以PCR为代表的分子生物学方法和以抗体为代表的免疫学方法可实现特异性致病菌的检测，但不具备广谱性，且以上所述方法均为集权平均分析方法，间接反映细菌浓度，由于细菌个体的代谢水平、酶含量和酶活等信号都有很大区别，集权平均分析方法在实际样品检测时往往不准确。

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行单颗粒水平快速定量检测分析和分选的技术，因其具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点，在细菌检测和鉴定方面独具优势，已成为产品质量控制、细菌致病机理以及微生物群落结构研究的重要手段。该方法可以快速、准确、特异性地检测食品中的致病菌和非致病菌的含量。目前，采用FCM检测食品或环境样本中的细菌主要是基于细菌核酸染色及免疫荧光法。但是，当FCM检测的对象为食用生蛋类样品时，存在以下问题：①粘稠状的蛋液无法满足FCM进样要求，经常发生仪器进样管的堵塞；②假阳性率较高；③检测信噪比较低。因此，当FCM检测对象为食用生蛋样品时，检测的进行极为困难。

发明内容

本公开的目的是提供一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数同时定量检测的方法，该方法能检测蛋液中的各种细菌，包括各种致病菌和非致病菌。

为了实现上述目的，本公开提供一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，该方法包括以下步骤：

S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆，得到蛋液样品；