[发明专利]用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液及其制备和应用

权利要求书

1.一种用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液，其特征在于：该注射液包括第5代人脐带间充质干细胞和液体溶媒，其中第5代人脐带间充质干细胞混悬于液体溶媒中，其浓度为2.0～3.0×10⁷个细胞/4.5ml～5.0ml液体溶媒；

所述液体溶媒为生理盐水，或自体富血小板血浆，或生理盐水与人血白蛋白的混合液，或生理盐水与自体富血小板血浆的混合液；

当液体媒溶为生理盐水与人血白蛋白的混合液时，所述人血白蛋白所占体积百分比5～8％；

当液体媒溶为生理盐水与自体富血小板血浆的混合液时，所述生理盐水占体积百分比小于或等于10％。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液，其特征在于：所述注射液在配制过程中添加或不添加地塞米松，当添加地塞米松时，其添加量为1mg/每ml注射液。

3.根据权利要求1所述的一种用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液，其特征在于：所述第5代人脐带间充质干细胞是由源于剖腹产手术婴儿的脐带组织中分离的高纯度间充质干细胞放置在完全培养基中进行培养，传代扩增至第5代的多能性间充质干细胞；其中，所述完全培养基是由无血清基础培养基和培养基添加物组成；所述无血清基础培养基包括LONZA UltraCULTURE培养基、DMEM/F12培养基、HyClone DMEM低糖液体培养基中的任意一种；所述培养基添加物为细胞生长因子L-Glutamine和血清替代物PALL UltroserG，其中L-Glutamine添加体积百分比为1～2％，PALL Ultroser G的添加体积百分比为2～5％。

4.根据权利要求1所述的一种用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液，其特征在于：所述自体富血小板血浆是从采集的病患自体血中分离出来的富血小板血浆。

5.一种用于治疗骨性关节炎软骨缺损的干细胞注射液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)第5代人脐带间充质干细胞的培养，其培养过程中使用的脐带间充质干细胞完全培养基是由无血清基础培养基和培养基添加物组成；所述基础培养基包括LONZAUltraCULTURE培养基、DMEM/F12培养基、HyClone DMEM低糖液体培养基中的任意一种；所述培养基添加物包括血清替代物、细胞生长因子；所述培养基添加物为细胞生长因子L-Glutamine和血清替代物PALL Ultroser G，其中L-Glutamine添加体积百分比为1～2％，PALL Ultroser G的添加体积百分比为2～5％，其具体培养步骤如下：

a.采集脐带：在胎儿娩出后，常规断脐，在脐带靠近胎盘端2～3cm处，用止血钳夹住脐带，然后在靠近止血钳处用丝线结扎，在结扎处和止血钳之间，用手术剪将脐带剪断，脐带的另一端也用丝线结扎，两个结扎点之间的脐带长度须大于20cm，并将脐带进行冲洗、消毒后置于采集瓶内；

b.分离脐带华通氏胶：将脐带在无菌环境下转移至无菌培养皿中测量脐带长度并记录，然后将其消毒冲洗，并切开去除脐带血管后，撕下位于羊膜与血管之间的华通氏胶放入无菌培养皿中，加入5～10ml磷酸盐缓冲液洗涤胶体；

c.华通氏胶组织匀浆块制备：将获得的华通氏胶转移至离心管内并反复剪碎制成1～4mm³的华通氏胶组织匀浆块，并在胶体匀浆块中加入脐带间充质干细胞完全培养基10～20ml，轻轻晃动，常温下在转速为1900转/min的条件下离心6分钟，弃除余下上清液，称重记录，按照重量培养；

d.组织块首次接种培养原代细胞及细胞收获：根据胶体重量，加入脐带间充质干细胞完全培养基约0.5g/ml，用电动移液器将步骤c中的胶体匀浆块反复吹打均匀，按0.5g/5-10ml比例在匀浆中加入脐带间充质干细胞完全培养基，混匀后按照15-20ml/瓶移至培养瓶内，并使组织匀浆块均匀分布于整个瓶底，置于含二氧化碳含量5±0.2％、温度37±0.5℃的恒温恒湿培养箱内，在原代培养的第12-14天，显微镜下培养液颜色橘黄细胞克隆团长至瓶底面积的70％-80％时，消化离心收获首次培养的原代细胞，离心收集贴壁未牢的残余组织块，对残余组织块进行二次培养；

e.组织块二次培养原代细胞及细胞收获：按原代细胞首次培养瓶数减半计算，并在培养瓶中加入10-20ml新鲜的脐带间充质干细胞完全培养基，将步骤d中收获的残留组织块吹打混匀后平均接种于新培养瓶中，置于含二氧化碳含量5±0.2％、温度37±0.5℃的恒温恒湿培养箱内进行二次培养5-6天，至细胞融合达瓶底面积85％～90％时，消化，离心收集二次培养的原代细胞；

f.细胞传代、扩增：将步骤d和e收集的原代细胞，以每cm²培养基5000～6000个细胞的密度接种至新的培养容器中置于原代细胞培养的同条件的恒温恒湿培养箱内进行传代培养，培养至细胞融合度达75％～85％时，收获第一代(P1)干细胞，并依次以同等密度传代，反复扩增培养至第五代；

(2)将步骤(1)中培养的第五代人脐带间充质干细胞按2.0～3.0×10⁷细胞/4.5～5ml的量混悬于液体溶媒中配制成干细胞注射液；其中，所述液体溶媒为生理盐水，或自体富血小板血浆，或生理盐水与人血白蛋白的混合液，或生理盐水与自体富血小板血浆的混合液；当液体媒溶为生理盐水与人血白蛋白的混合液时，所述人血白蛋白所占体积百分比5～8％；当液体媒溶生理盐水与自体富血小板血浆的混合液时，所述生理盐水所占体积百分比小于或等于10％。