[发明专利]一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型

说明书

本发明公开了一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型。该斑马鱼为Tg(fabp10a:il34)转基因的斑马鱼。本发明通过以下步骤实现：（1）斑马鱼养殖；（2）斑马鱼胚胎整体原位杂交和抗体染色；（3）激光扫描共聚焦荧光显微镜活体成像。本发明首次证实了在肝脏异位表达、过表达的白细胞介素34可以诱导巨噬细胞向肝脏富集，并运用活体显像技术提供了坚实而直接的证据。另外，本发明中Tg(fabp10a:il34;mpeg1:GFP)成鱼具有以下表型：①巨噬细胞数目仅特异性的在肝脏区域增高；②其他组织区域如尾部造血组织（CHT）区域巨噬细胞数目不变；③粒细胞数目不变。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型。

背景技术

巨噬细胞是髓系细胞的一种，也是免疫系统的重要组成部分，在清除生物体中的外来物质(包括细胞碎片、微生物和癌细胞)过程中发挥着关键作用。在成年哺乳动物中，这些大型吞噬细胞存在于它们进行免疫监测的所有组织中，能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。巨噬细胞可以根据其在不同组织中的位置分为库普弗细胞、小胶质细胞和朗格汉斯细胞等几种类型，但一般来说，它们都是单核吞噬细胞系统的一部分。

白细胞介素34(IL-34)是一类细胞因子，也是一种由多种细胞分泌的蛋白质，包括巨噬细胞、内皮细胞、神经元和成纤维细胞。IL-34广泛表达于脑、心、肝、脾、肾、结肠等多种组织，主要分布于皮肤和中枢神经系统(CNS)。在最近的研究中，IL-34被认为是巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR；又称CSF-1R)的另一种有功能的配体，并被认为参与巨噬细胞的增殖、分化和存活。除此之外，IL-34还被认为能诱导髓系细胞(THP-1和M2a巨噬细胞)迁移，这一过程主要通过Syndecan-1依赖的机制。此外，IL-34通过增加黏着斑激酶(FAK)和细胞外信号相关激酶1和2(ERK 1/2)的磷酸化水平，参与诱导巨噬细胞的浓度依赖性的趋化过程，但在体内缺乏IL-34诱导巨噬细胞聚集的直接证据，现有技术大多是在体外细胞系实验中进行验证，尚缺乏在体内实验中的证据，也无在体内环境中实时观察巨噬细胞聚集在肝脏的直接证据。

脂肪酸结合蛋白10a(fabp10a)是一种小蛋白质，对肝内长链脂肪酸的胞内结合和转运起重要作用。2.8kb的启动子序列可以有效地驱动GFP(绿色荧光蛋白)在肝脏中的表达，在受精后2天可首次观察到荧光，并可持续到成年期。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型。

本发明的目的通过下述技术方案实现。

肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型，具体步骤为：

(1)通过聚合酶链式反应利用野生型斑马鱼基因组DNA得到斑马鱼肝脏细胞特异性启动子——脂肪酸转运蛋白10a，同时通过聚合酶链式反应利用野生型斑马鱼cDNA得到白细胞介素34基因，将这两部分片段利用DNA连接酶分段连接进入空载pBLK-sv40构建pBLK-fabp10a-il34-sv40质粒，利用显微注射技术将此质粒注射入已标记了的转基因家系Tg(mpeg1:GFP)(即利用巨噬细胞特异性的启动子——巨噬细胞表达1来驱动绿色荧光蛋白在巨噬细胞中表达的转基因斑马鱼)斑马鱼卵中，然后用白细胞介素34的RNA探针进行原位杂交技术鉴定，观察在瞬时表达情况下白细胞介素34在斑马鱼体内的特异性表达情况，在肝脏瞬时表达白细胞介素34情况下，通过抗体染色鉴定巨噬细胞在肝脏部位特意性聚集情况；