[发明专利]一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用

权利要求书

1.一种产两性霉素B的重组结节链霉菌(Streptomyces nodosus)，其特征在于，所述重组结节链霉菌由保藏编号：CCTCC NO：M 2017426的结节链霉菌ZJB2016050敲除SEQ IDNO.6所示的PKS5基因簇后，再导入SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因、SEQ ID NO.2所示乙酰辅酶A羧化酶2基因、SEQ ID NO.3所示聚酮合酶PKSamphA基因、SEQ ID NO.4所示甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和SEQ ID NO.5所示甲基丙二酰辅酶A异构酶基因的串联基因获得。

2.权利要求1所述的重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO₃ 5～10g/L，KH₂PO₄ 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵罐压力0.05MPa，通气比0.08～1.5vvm。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产两性霉素B的重组结节链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液，将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成为：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH7.2；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO₃ 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0。