[发明专利]一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用，所述重组结节链霉菌是敲除结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)内两性霉素B的竞争支路后，再将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示功能基因串联序列导入获得的；通过导入功能基因，使两性霉素B骨架合成前体供给量全面提升，提高菌种对营养物质的利用率，改变目标产物的营养物质流向。通过敲除竞争支路提高AmB产量约20％，副产物两性霉素A降低40％，通过过表达串联功能基因验证提高三类前体乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A大幅提升两性霉素B的产量，最终在5L发酵罐发酵，两性霉素B产量可达到16g/L。

(一)技术领域

本发明涉及一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用。

(二)背景技术

两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是一种多烯类广谱抗真菌抗生素，由结节链霉菌(Streptomyces nodosus)产生，其菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获得。1966年开始上市，是第一个用于深部真菌感染的药物，已使用近半个世纪。AmB分子式C₄₇H₇₃NO₁₇，AmB属于多稀大环内酯类抗生素，具有广谱性的对真菌抗性，特别是对于具有生命威胁性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉属真菌等，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等，目前市场流通的两性霉素B药物包括注射液，药片等。AmB为黄色或橙黄色粉末，无味，有引湿性，在日光下易破坏失效。能溶解DMSO，在水，无水乙醇，三氯甲烷或乙醚中基本不溶，(pH 6-7)均少于1mg/L。AmB的抗真菌作用机制为：AmB能与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在膜上形成微孔，使膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内容物K离子、核苷酸、氨基酸等无节制的流失而造成菌体死亡。然而AmB也会在较小程度上与哺乳动物细胞膜上的胆固醇相互作用，造成一定的副作用，特别是肾毒性。虽然其具有一定的副作用，但AmB仍然是目前治疗人类深部全身性真菌感染的最重要一种抗生素。人们加强了对AmB新给药形式的研究，例如在20世纪90年代出现的Abelcet、Ambisome脂质体药物，为了降低毒性，提高药物到达作用区域的效率。也有发酵方向和传统诱变的研究进展，如2017年张博等对野生型结节链霉菌进行诱变，提高了两性霉素B的产量至5.02g/L，在诱变菌种的发酵进行优化，最终实现高产量两性霉素B的工业化。

微生物代谢改造的方式有很多，其中常用的方法有过表达功能基因、敲除竞争支路、异源表达合成基因簇等。功能基因的过表达在菌种代谢改造中是主要的手段之一且见效快。结节链霉菌的主要遗传手段是接合转移，已有参考资料显示结节链霉菌的接合转移的结合率相比模式链霉菌较低，其中类似pSET152，PKC1139等整合型或温敏性质粒的成功率在操作和成功几率更加低。pJTU1278作为表达型质粒是目前本实验室唯一成功进行接合转移的质粒。

两性霉素B骨架主要由18个合成前体和一个起始单元组成，起始单元由聚酮合酶模块amphA结合一个乙酰辅酶A构成，后续由15个丙二酰辅酶A和3个甲基丙二酰辅酶A逐步组成。其中乙酰辅酶A主要来源于葡糖糖的糖酵解路径，丙二酰辅酶A主要由乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶的作用下合成，甲基丙二酰辅酶A合成由两个路径，一条由琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰异构酶和变位酶作用下合成，一条由丙酰辅酶A在丙酰辅酶A羧化酶作用下合成。乙酰辅酶A是生物代谢的核心物质，在生物体内代谢支路复杂，是次级代谢产物的主要前体之一。

链霉菌属是放线菌的一种，被称为次级代谢产物的天然宝库，一种链霉菌往往会带有多个次级代谢产物合成基因簇，有些可能是沉默基因簇，在特定的应激作用下才能实现表达。另一部分可能处于不同的表达状态，也有存在竞争性的作用。在结节链霉菌内存在5种PKS类型合成基因簇，其中两性美素B属于PKS I型。根据antiSMASH的预测结果及KEGG数据推论，发现PKS5的次级代谢产物可能会对两性美素B的合成具有竞争作用。

(三)发明内容