[发明专利]一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒

说明书

一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒。引物组合物包括两条外引物AV‑F3引物和AV‑B3引物、两条内引物AV‑FIP引物和AV‑BIP引物。检测维氏气单胞菌的试剂盒包含A溶液、B溶液和C试液：A溶液中含有上述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物、dNTPs、10×lamp buffer、Mg2+和BstDNA聚合酶；B溶液为维氏气单胞菌基因组DNA阳性对照液；C试液为无菌水。采用本发明的检测维氏气单胞菌的试剂盒对维氏气单胞菌进行检测，具有较高的准确度、灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于水产病原菌及食源性致病菌检测技术领域，具体地，涉及一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒。

背景技术

维氏气单胞菌是引起水产动物疾病的重要病原菌及食源性致病菌，是人-鱼共患致病菌，可以引发人急性腹泻、脑膜炎、肠胃炎、菌血症等疾病。维氏气单胞菌具有气单胞菌属典型的毒力因子，如气溶素、肠毒素等，对水产动物有较高的致死率，给养殖业造成了巨大损失。维氏气单胞菌具有气单胞菌属典型的毒力因子气溶素、肠毒素等，目前，维氏气单胞菌的鉴定主要是靠生理生化方法和分子生物学方法。由于生理生化鉴定费时费力，相对依赖实验室条件，并且分类依据和判定标准更新滞后，结果可靠性不强，有报道称API20E细菌鉴定系统误把维氏气单胞菌鉴定为嗜水气单胞菌。分子生物学方法基于16SrRNA的分析技术也用于鉴定维氏气单胞菌，但由于气单胞菌属的16SrRNA有较高相似性，种与种的相似性多超过98％，仅利用于16SrRNA基因相似性往往难以准确检测维氏气单胞菌。

日本科学家Notomi等人发明了一种新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其基本原理是针对靶基因的6个区域，设计4条特异性引物(FIP,BIP,F3,B3)，在链置换BstDNA聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达10⁹-10¹⁰个数量级。LAMP反应具有较高的专一性，只有四条引物在靶基因中的6个不同区域完全匹配才能进行扩增。这种技术具有的特点是特异性强、高效、快速、简便、灵敏度高。目前，在微生物检测方面，LAMP技术对沙门氏菌、副溶血弧菌、分歧杆菌、嗜水气单胞菌以及病毒方面的流感病毒、口蹄疫病毒检测等已有研究，但对于建立维氏气单胞菌LAMP检测方法的研究还处于相对匮乏的水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物：包括两条外引物AV-F₃引物和AV-B₃引物、两条内引物AV-FIP引物和AV-BIP引物；AV-F₃引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，AV-B₃引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，AV-FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，AV-BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

根据本发明的另一个方面，提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物在制备检测维氏气单胞菌的试剂盒中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供一种检测维氏气单胞菌的试剂盒：包括A溶液，A溶液中含有上述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物、dNTPs、10×lamp buffer、Mg²⁺和BstDNA聚合酶。

优选地，A溶液中的引物组合物满足如下浓度比例：AV-FIP引物：AV-BIP引物：AV-F₃引物：AV-B₃引物＝6:6:1:1。