[发明专利]基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法

权利要求书

1.一种基于重组酶扩增和G-四连体DNAzyme的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以NaOH溶液裂解待测样品细胞壁结构，得到待测样品的基因组DNA粗提液；

(2)根据目的基因设计用于进行RPA反应的特异性引物1和引物2；

(3)构建包括步骤(1)中提取分离的所述基因组DNA，步骤(2)中所述引物1和引物2的RPA扩增反应体系，进行不对称RPA反应，反应得到带有G-四连体序列的单链DNA和双链DNA扩增产物；

(4)加入Hemin、NH₄⁺进行孵育，单链DNA 3′-末端折叠成具有G-四连体结构的DNAzyme；

(5)最后向含有所述具有G-四连体结构的DNAzyme的溶液中加入一定浓度的ABTS和H₂O₂，直接观察颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性。

2.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，所述基因组DNA的提取分离方法为：将所述待测样品加入0.5M NaOH、10mmEDTA进行研磨，再利用10mM Tris-Cl，1mmEDTA pH8.0的缓冲液稀释10倍，所得到的上清液为基因组DNA粗提液。

3.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，所述引物1的基因序列如SEQ ID NO.1所示5′-CCCAATCCCAATCCCAATCCCTCGATTCGAGGGCCGGCCACCAGAGGATGTG-3′,引物2的基因序列如SEQ ID NO.2所示，5′-CAACACGAATCGCTTCCTGACGAAGACAGAAG-3′。

4.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述RPA扩增反应体系包括：1μL基因组DNA，25μL2x反应缓冲液，9μLdNTP(10 Mm)，5μL10x碱性E-mix，2.4μL引物1(10μM)，2.4μL引物2(10μM)，2.5μl20x核心反应mix，2.5μL醋酸镁(280mM)，46.5μL水。

5.如权利要求4所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，所述RPA扩增反应体系的反应条件为：反应温度的温度梯度为42℃-34℃或37℃-34℃，反应时间为5-30min，然后加热至85℃保持5min。

6.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，所述G-四连体结构的DNAzyme的反应条件为：加入终浓度为0.6μM的Hemin和含有NH₄⁺的缓冲溶液，所述含有NH₄⁺的缓冲溶液内包括50mM Tris-HCl,150mM NH₄Cl，pH7.9，孵育时间为60min。

7.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，步骤(6)中所述ABTS的终浓度为2mM，所述H₂O₂的终浓度为2mM。

8.如权利要求1所述的一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，其特征在于，步骤(6)中所述H₂O₂的终浓度为2mM，所述ABTS的终浓度为2mM。