[发明专利]基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法

说明书

本发明公开了一种基于重组酶扩增和G‑四连体DNAzyme的层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)目视检测方法，包括以下步骤：(1)以NaOH溶液裂解待测样品细胞壁结构，得到基因组DNA粗提液；(2)根据目的基因设计用于进行RPA反应的特异性引物1和引物2；(3)以粗提液中的基因组DNA为模板进行不对称RPA反应，反应得到带有G‑四连体序列的单链和双链DNA扩增产物；(4)在含有扩增产物的溶液中加入hemin和NH₄⁺，孵育1小时，单链DNA3′‑末端折叠成具有G‑四连体结构的DNAzyme；(5)最后向含有该酶的溶液中加入一定浓度的ABTS和H₂O₂，二十分钟后观察颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性。

技术领域

本发明属于光学生物传感技术领域，具体涉及一种基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法。

背景技术

由层出镰刀菌导致的植物腐烂病是危害较为严重的维管束病害。该病寄主十分广泛，能侵染番茄、茄子、青椒、白瓜、甜瓜、草诗、秋葵、白菜、萝卜、蜂斗菜、土当归、刺老芽、黄豆、菊、蔷薇、油菜等。

传统的病害检测方法有聚合酶链式反应和血清学方法。这两种技术已成为诸多生物学、医学实验室、检测机构和生物医药公司的常规实验方法。但它们需要核酸扩增仪，酶标仪等作为辅助工具，因此反应始终受到电力、成本、时间以及空间等因素的制约，从而限制了该技术在实验室之外的应用。

目前常用的等温扩增DNA的成熟方法有环介导基因恒温扩增技术 (loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术 (recombinasepolymeraseamplification，RPA)。LAMP扩增方法的特点是需使用4～6 个引物，在特定DNA聚合酶作用下，65℃的恒温条件下进行DNA扩增反应。其缺点之一是其引物较复杂，必须用特殊的软件设计。其二，LAMP方法得到的扩增产物是一系列大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

重组酶聚合扩增法(RPA)系统能在较低温度下就能实现DNA扩增，并可在 15～30min内完成反应。所以RPA扩增技术就不需要使用核酸扩增仪，因而也不受样品槽孔多少和空间的限制，从而实现实时高通量检测。另外，RPA能够以未纯化模板进行扩增，这在现场检测中具有很大的优势。

对于重组酶检测病原体比如动物病毒、疟原虫、支原体、植物真菌、植物病毒，检验人体的，检验食物的牛奶的等等，都有很多报道，但多数方法是重组酶扩增后通过侧流检测。这种检测方法虽然简单快速，但是不能精确定量。制备侧流试纸需要花费财力物力，并且试纸是一次性的，不适合大规模检测。据报道，重组酶扩增可放入手掌并握拳，通过体温加热，反应完成后加入SYBR GreenⅠ，以紫外手电检测。这种方法简单方便，但是每次只能检测两三个样品，且SYBR GreenⅠ没有特异性，能够和任意双链DNA结合，因此会受到引物二聚体及其他非特异性扩增的影响。

目视检测方法因其操作简单且直观越来越受到重视。金胶法是一种常用的目视检测方法。但是一定直径的纳米金胶并不容易制备。在检测中金胶容易受到基因组DNA和蛋白的作用而发生聚集，从而影响结果。作为替代方法，基于G- 四连体的比色法已经用来检测多种核酸、蛋白等。在hemin存在下，G-四连体 DNAzyme能够催化H₂O₂与ABTS(2,2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸))的反应，生成的产物具有特征的绿色并在λ＝422nm处有特征吸收。G-四连体能够重新组装成具有催化活性的G-四连体DNAzyme。

因此，针对层出镰刀菌建立一种检测成本低、检测精确度高的检测方法很有必要。

发明内容