[发明专利]一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用，涉及基因工程领域。该阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺、阳离子聚丙烯酰胺、阳离子脂质体、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和维生素D。通过优化阳离子型转染试剂的组分，降低了细胞毒性，显著提高了转染效率，293FT细胞转染率达到95％以上。另外，可在贴壁细胞传代尚未贴壁时立即进行转染，能做到立传立转，转染操作简单、快速，可在一分钟内完成，可广泛用于各种哺乳动物细胞的快速大量瞬时转染。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用。

背景技术

细胞转染是一种将外源基因导入真核细胞的技术，广泛应用于蛋白表达定位、基因功能研究、基因表达调控和基因治疗等方面，是基因工程领域重要的工具。细胞转染的方式可分为物理、化学和生物三类。其中物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪等；化学介导方法有阳离子脂质体法、磷酸钙共沉淀法和阳离子聚合物法等；生物介导方法主要是病毒介导的转染方法。虽然病毒介导的转染方法具有转染效率高，稳定性好，细胞毒性低等优点，但存在着在人体内有自我复制的风险，且实际操作程序复杂，成本较高。非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点，阳离子型转染试剂在实际应用中更是受关注。

阳离子脂质体法和阳离子聚合物法相比于其他转染方法，具有具有生物安全性高,细胞毒性小,操作简便等优点，也是目前比较常用的细胞转染方法。它们通过自身带有的阳离子可以快速的与阴离子(DNA、RNA)结合，形成带正电荷的聚合物，并与带负电荷的细胞膜融合，通过内吞作用将DNA、RNA导入细胞。在利用阳离子脂质体和阳离子聚合物进行细胞转染的过程中，转染试剂的选取及其转染条件的优化直接影响转染的效率。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)和壳聚糖等。其中PEI是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子聚合物，每相隔两个碳原子就有质子化的氨基氮原子，使得该聚合物在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”。有研究表明，PEI的转染效率和细胞毒性主要是由分子量、支链化程度和阳离子电荷密度决定的，随着分子量的增大，转染效率逐渐提升，细胞毒性也上升；直链PEI分子与支链PEI分子相比细胞毒性更低，转染效率更高。PEI具有成本低，应用简便，可以在多种哺乳动物细胞中达到较高的转染效率，适用于无血清悬浮转染环境等优点。因此，PEI已经成为大规模基因瞬时表达领域最广泛使用的转染试剂。

转染试剂是影响转染效果主要因素，不同的宿主细胞适用的转染试剂也不同。在现有技术中，中国专利CN109136270A公开了一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用，该转染试剂包括阳离子聚合物、重组多肽和阳离子脂质体，利用该阳离子聚合物基因转染试剂转染48h后的细胞存活率为93.66％，毒性较低。中国专利CN102399809A公开了一种非病毒型转染试剂、其与质粒DNA复合物制备方法及应用，将PEI与磷酸钙组合转染细胞，转染后24小时的存活率大于90％。虽然转染试剂在不断完善，但仍存在一定的缺陷，比如：转染效率较低；转染后细胞存活率仍需提高；对于贴壁细胞传代时不能做到立传立传(即在贴壁细胞传代尚未贴壁时立即进行转染)；转染操作耗时较长等。因此，亟需开发一种高效、低毒、可快速大量瞬时转染表达目的蛋白，或大量制备各种病毒载体和假病毒的转染试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阳离子型转染试剂及其制备方法和在细胞转染中的应用。克服了现有技术存在的缺陷，该阳离子型转染试剂具有高效、低毒和易于使用等优点。

本发明一方面提供了一种阳离子型转染试剂，所述的阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺、阳离子聚丙烯酰胺、阳离子脂质体、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和维生素D；

所述的阳离子脂质体包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵和双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺中的任一种。

优选地，所述的阳离子脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺。