[发明专利]表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒及其构建方法和应用，重组病毒包括病毒载体和包装于所述病毒载体中的带有16型蓝舌病病毒VP2基因的重组穿梭质粒，所述16型蓝舌病病毒VP2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在国内外首次构建并筛选了表达16型蓝舌病病毒（BTV‑16）VP2基因的重组病毒rVTT‑VP2，并对其使用分子生物学方法进行了鉴定。通过10次反复噬斑纯化，连续传20代次，PCR鉴定结果显示VP2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中，且未能扩增出TK基因，表明重组痘苗病毒rVTT‑VP2遗传稳定性良好，而且病毒已经纯化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒及其构建方法和应用。

背景技术

蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）是呼肠孤病毒科环状病毒属成员。其传染主要借助节肢动物如库蠓、沙蝇等。蓝舌病是世界动物卫生组织（Office International DesEpizooties，OIE）规定必报的动物传染疫病，我国在加入世界贸易组织后也规定为一类动物疫病。蓝舌病的重大危害主要体现在绵羊和山羊的高致死率，每年导致的经济损失大概在3亿美元以上，人力物力消耗巨大。至2019年，蓝舌病已有27种血清型，中国至少有7种BTV血清型，但主要流行血清型为BTV-1型和16型。蓝舌病病毒VP2作为蓝舌病病毒衣壳蛋白，在病毒吸附过程中发挥重要作用，是决定血清型的特异性抗原。该抗原能刺激机体产生特异性中和抗体以保护动物，是蓝舌病新型基因工程疫苗研究的首选抗原。目前商用疫苗包括减毒疫苗和灭活疫苗，国内外尚未进行蓝舌病16型重组疫苗的研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒及其构建方法和应用。

一种表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒，包括病毒载体和包装于所述病毒载体中的带有16型蓝舌病病毒VP2基因的穿梭质粒，所述16型蓝舌病病毒VP2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

在其中一个实施例中，所述病毒载体为痘苗病毒载体，所述穿梭质粒为痘苗病毒穿梭质粒pSTKE。

在其中一个实施例中，所述16型蓝舌病病毒VP2基因的上游还具有kozak序列。

一种表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒的构建方法，包括如下步骤：提供含有16型蓝舌病病毒VP2基因的质粒，利用扩增引物对16型蓝舌病病毒VP2基因进行PCR扩增，将扩增得到的16型蓝舌病病毒VP2基因插入到穿梭质粒中得到重组穿梭质粒，将所述重组穿梭质粒和病毒转染至细胞中，2~3天后筛选收集得到所述表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒。

在其中一个实施例中，所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在其中一个实施例中，所述将扩增得到的16型蓝舌病病毒VP2基因插入到穿梭质粒中的步骤包括：将扩增得到的16型蓝舌病病毒VP2基因与pEasy克隆载体连接得到pEasy-VP2，然后通过双酶切和连接将16型蓝舌病病毒VP2基因连接到穿梭质粒中得到重组穿梭质粒。

在其中一个实施例中，所述双酶切使用的酶为XbaⅠ和SalⅠ。

在其中一个实施例中，所述病毒为痘苗病毒天坛株，所述穿梭质粒为痘苗病毒穿梭质粒pSTKE。

在其中一个实施例中，所述细胞为BHK-21细胞。

一种上述表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组病毒在制备蓝舌病疫苗中的应用。