[发明专利]一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统

权利要求书

1.一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建包含PAM序列的质粒文库

1)设计并合成包含gRNA靶位点和若干个兼并碱基的寡核苷酸单链PAM序列文库；gRNA靶位点由gRNA结合序列与PAM序列组成，PAM序列由2个以上碱基N串联组成，所述碱基N为碱基A、T、C或G；

2)通过PCR将寡核苷酸单链PAM序列文库变为双链DNA；

3)将双链DNA插入至启动子与荧光报告基因之间，启动子用于下游荧光报告基因的转录；

4)提取质粒，即完成包含PAM序列的质粒文库的构建；

(2)构建包含PAM序列的慢病毒文库

1)将哺乳动物细胞铺板至培养皿中；

2)将包含PAM序列的质粒文库与慢病毒辅助质粒共转染哺乳动物细胞；

3)收集慢病毒上清，并进行浓缩；

4)测定慢病毒滴度，即完成包含PAM序列的慢病毒文库的构建；

(3)构建包含PAM序列文库的细胞系；

(4)流式分选去除荧光报告基因假阳性背景；

(5)转染Cas9蛋白和gRNA或表达Cas9蛋白和gRNA的载体至包含PAM序列文库的细胞系进行编辑；

(6)流式分选出荧光报告基因阳性细胞，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，通过PCR构建二代测序文库；

(7)生物信息学分析二代测序结果，找出能够产生基因编辑的PAM序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，gRNA靶位点及兼并碱基位于起始密码子ATG和荧光报告基因之间。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，启动子选自CMV、EF1α、SV40、PGK1、Ubc、CAG、TRE或human beta actin中的任一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光报告基因选自GFP、RFP、BFP、EGFP、mCherry、mStrawberry、mApple、mRuby或EosFP中任一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，哺乳动物细胞包括但不限定于HEK293T细胞、HEK293细胞、HeLa细胞、HIH3T3细胞、U2-OS骨肉瘤细胞、A549细胞、K562细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，构建包含PAM序列文库的细胞系的方法如下：

1)将哺乳动物细胞铺板至培养皿中；

2)将包含PAM序列的慢病毒文库感染哺乳动物细胞；

3)用抗生素进行筛选后，即得到包含PAM序列文库的细胞系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，编辑2天～7天。

8.一种基于权利要求1所述的方法的系统，其特征在于，其包括启动子、gRNA靶位点、兼并碱基和荧光报告基因；启动子用于下游荧光报告基因的转录，gRNA靶位点由gRNA结合序列与PAM序列组成，PAM序列由2个以上碱基N串联组成，所述碱基N为碱基A、T、C或G；gRNA靶位点及兼并碱基位于ATG起始密码子和荧光报告基因之间。