[发明专利]一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统

说明书

本发明属于基因编辑技术领域，具体为一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统。本发明方法的具体步骤如下：(1)构建包含PAM序列的质粒文库；(2)构建包含PAM序列的慢病毒文库；(3)构建包含PAM序列文库的细胞系；(4)流式分选去除荧光报告基因假阳性背景；(5)转染CRISPR/Cas至包含PAM序列文库的细胞系进行编辑；(6)流式分选出荧光报告基因阳性细胞，通过PCR构建二代测序文库；(7)生物信息学分析二代测序结果，找出能够产生基因编辑的PAM序列。本发明将快速筛选出在哺乳动物细胞中能产生基因编辑的CRISPR/Cas系统，并通过测序找出其需要的PAM序列。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas基因编辑系统PAM序列的方法和系统。

背景技术

CRISPR/Cas系统是原核生物在长期进化中形成的一种获得性免疫，用于抵抗外源质粒和噬菌体的入侵。研究表明，靶向序列附近必须有PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列时，CRISPR/Cas系统才能实现对靶位点的识别和切割。因此准确地鉴定出CRISPR/Cas系统识别的PAM序列是利用其进行基因编辑的必要条件。

目前用于鉴定CRISPR/Cas系统所识别PAM序列的方法主要有两种，一种是用Cas蛋白和gRNA体外切割含有多种PAM的靶向DNA序列，然后将酶切产物进行二代测序分析识别的PAM序列；另一种是在细菌中将PAM序列和抗性基因结合，通过负向筛选以及二代测序分析识别PAM序列。但是研究表明利用这两种方法鉴定出来的CRISPR/Cas系统在哺乳动物细胞中不一定能有活性。利用体外切割实验鉴定PAM序列时，鉴定的结果受反应条件的影响。

鉴于以上问题，特提出本发明。

发明内容

本发明提供一种基于报告基因的检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统，本发明能快速筛选出在哺乳动物细胞中能产生基因编辑的CRISPR/Cas系统，并通过测序找出其需要的PAM序列。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法，具体步骤如下：

(1)构建包含PAM序列的质粒文库

1)设计并合成包含gRNA靶位点和若干个兼并碱基的寡核苷酸单链PAM序列文库；gRNA靶位点由gRNA结合序列与PAM序列组成，PAM序列由2个以上碱基N串联组成，所述碱基N为碱基A、T、C或G；

2)通过PCR将寡核苷酸单链PAM序列文库变为双链DNA；

3)将双链DNA插入至启动子与荧光报告基因之间，启动子用于下游荧光报告基因的转录；

4)提取质粒，即完成包含PAM序列的质粒文库的构建；

(2)构建包含PAM序列的慢病毒文库

1)将哺乳动物细胞铺板至培养皿中；

2)将包含PAM序列的质粒文库与慢病毒辅助质粒共转染哺乳动物细胞；

3)收集慢病毒上清，并进行浓缩；

4)测定慢病毒滴度，即完成包含PAM序列的慢病毒文库的构建；

(3)构建包含PAM序列文库的细胞系；

(4)流式分选去除荧光报告基因假阳性背景；

(5)转染Cas9蛋白和gRNA或表达Cas9蛋白和gRNA的载体至包含PAM序列文库的细胞系进行编辑；

(6)流式分选出荧光报告基因阳性细胞，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，通过PCR构建二代测序文库；