[发明专利]一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法

说明书

本发明提供了一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法，所述表达载体由甘油磷酸氧化酶表达载体构建而来，在核糖体结合位点与起始密码子之间插入基因表达调节元件。本发明的有益效果体现在：本发明构建的重组甘油磷酸氧化酶表达载体酶活高，极大的提高了甘油磷酸氧化酶的应用能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法。

背景技术

甘油磷酸氧化酶（glycerophosphate oxidase，GPO）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅因子的氧化酶，能够将L-α-glycerophosphate转化为磷酸二羟丙酮，并释放出过氧化氢。甘油磷酸氧化酶主要应用于临床生化诊断方面，与脂酶和甘油激酶共同作用，用于临床检测体内甘油三酯或丙三醇的含量，辅助监测心血管疾病的发生和发展。

甘油磷酸氧化酶来源广泛，包括链霉菌，粪球菌和乳酸杆菌等微生物内的甘油磷酸氧化酶基因已经完成鉴定。目前国内研究相对较少，大部分集中于从原始微生物中直接提取，例如张斯民等从支原体中进行了甘油磷酸氧化酶的克隆和酶学鉴定 ^[1] ；包凌晟等从粪肠球菌中进行了甘油磷酸氧化酶的提取^[2]；余彩霞等进行了粪肠球菌的筛选和培育，并进行了发酵生产条件的优化^[3]。尽管相关工作较多，但是由于相关生产菌株培养条件复杂，酶产量较低的问题，导致甘油磷酸氧化酶产品生产工艺复杂，价格较高，不能进行大规模发酵生产，直接制约了甘油磷酸氧化酶的应用。

大肠杆菌是酶制剂生产中最为常用的宿主菌株，具有培养条件简单，基因背景清楚，蛋白表达产量高和发酵技术成熟等特点。但是我们在进行甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌表达过程中发现，使用现有的大肠杆菌表达体系，生产的甘油磷酸氧化酶活力显著低于原始菌株来源的酶产品活力。因此，需要进行表达系统的改进优化，以进一步提高甘油磷酸氧化酶在大肠杆菌中的表达活力。

[1]张斯民.绵羊肺炎支原体甘油-3-磷酸氧化酶基因的克隆、表达及重组产物的纯化[D].宁夏大学,2013。

[2]包凌晟,杜林方,李海林,聂宇,孟延发.产磷酸甘油氧化酶菌株的鉴定及其酶学性质研究[J].中国酿造,2008(11):15-18。

[3]余彩霞. 产磷酸甘油氧化酶菌种的筛选、鉴定及酶的分离纯化与性质研究[D].四川大学,2006。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体，所述表达载体由甘油磷酸氧化酶表达载体构建而来，在核糖体结合位点与起始密码子之间插入基因表达调节元件。

优选地，所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，包括如下步骤，

S1、甘油磷酸氧化酶表达载体的构建；

S11、合成甘油磷酸氧化酶基因片段，所述甘油磷酸氧化酶基因序列如SEQ IDNO.1所示；

S12、选取pET系列表达质粒；

S13、将S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段插入到S12中的表达质粒中；

S2、在所述S1构建的甘油磷酸氧化酶表达载体中采用定点突变的方式插入基因表达调节元件获得重组的甘油磷酸氧化酶表达载体；所述基因表达调控元件为胞嘧啶和鸟嘌呤组成的核苷酸序列。

优选地，所述S13中包括如下步骤：

S131、对S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段及S12中的表达质粒进行双酶切；

S132、对经过酶切后的甘油磷酸氧化酶基因片段和表达质粒进行纯化；