[发明专利]一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种新型溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为包含SEQ ID NO:3所示αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21目的基因的重组痘苗病毒天坛株，命名为痘苗病毒天坛株rTV-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其保藏编号为：CCTCC NO:V201934，保藏日期为2019年5月21日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述新型溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用, 其特征在于，所述肿瘤选自前列腺癌以及肺癌。

3.权利要求1所述的αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21重组痘苗病毒天坛株的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成人αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21，其基因序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)将αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒pSC65的TK区中，构建出重组质粒pSC65-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21；

(3)采用基因同源重组的方式，将pSC65-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21质粒转染到已经被感染了野生型痘苗病毒的TK143^-细胞中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rTV-αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21；经筛选后，获得所述TK区包含序列SEQID NO：3序列的重组溶瘤痘苗病毒；其中，αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21基因由痘苗病毒的早/晚期启动子p7.5 控制；

（4）对获得的重组溶瘤痘苗病毒进行扩增。

4.根据权利要求3所述的αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21重组痘苗病毒天坛株的制备方法，其特征在于，步骤（4）重组溶瘤痘苗病毒进行扩增具体步骤包括： VERO细胞生长密度达100％时滴入αCTLA4-Fc(ALIE)-IL21重组痘苗病毒天坛株，更换低浓度胎牛血清的维持培养基，每10 cm 培养板接种量为0.02 MOI溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养,重组痘病毒扩增完毕后，收集病毒液再反复冻融后，用蔗糖溶液进行密度梯度离心纯化。