[发明专利]一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法

权利要求书

1.一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)游离循环肿瘤DNA的提取：经EDTANa2抗凝的外周血，室温500g离心5分钟后，取上层血浆，经PAXgene Blood ccfDNA Tubes试剂盒按照说明书提取游离循环肿瘤DNA，置于1.5ml EP管中，冻存于-80℃，作为后续PCR的模板；

(2)TP53基因4-8号外显子PCR扩增：以步骤(1)所获得的DNA10ng作为第一轮PCR模板，配置含有特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件的PCR反应体系进行两轮巢式PCR扩增；

(3)TP53基因突变检测：经两轮巢式PCR产物扩增后，取15ulPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，对阳性条带进行割胶回收，连接到pGEM T-easy载体，4℃连接过夜后转化感受态细菌，涂布氨苄青霉素平板后经蓝白斑筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增后进行直接测序法检测TP53突变。

2.根据权利要求1所述的一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，其中步骤(2)中所述特异性引物对由以下8对引物组成：

特异性引物对1由正义引物SEQ ID NO.1和反义引物SEQ ID NO.2构成；

特异性引物对2由正义引物SEQ ID NO.3和反义引物SEQ ID NO.4构成；

特异性引物对3由正义引物SEQ ID NO.5和反义引物SEQ ID NO.6构成；

特异性引物对4由正义引物SEQ ID NO.7和反义引物SEQ ID NO.8构成；

特异性引物对5由正义引物SEQ ID NO.9和反义引物SEQ ID NO.10构成；

特异性引物对6由正义引物SEQ ID NO.11和反义引物SEQ ID NO.12构成；

特异性引物对7由正义引物SEQ ID NO.13和反义引物SEQ ID NO.14构成；

特异性引物对8由正义引物SEQ ID NO.15和反义引物SEQ ID NO.16构成；

所述DNA聚合酶为Hot-star DNA聚合酶，属热启动DNA聚合酶；

所述PCR常规组件包括dNTPs混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。

3.根据权利要求1所述的一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中第一轮PCR反应每50ulPCR反应体系中的组分如下：

正义引物1ul，反义引物1ul，模板DNA10ng，10×缓冲液5ul，dNTPs混合液4ul，hot-starDNA聚合酶0.25ul，用去离子水补充到50ul体积；第二轮PCR反应体积模板DNA由5ul第一轮PCR产物代替，其余组成成分与第一轮PCR反应组成成分一致。

4.根据权利要求1所述的一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)第一轮PCR反应条件为：95℃5分钟；94℃30秒，50℃30秒，68℃2分钟，25个循环,，68℃7分钟；第二轮PCR反应条件为：95℃5min；87℃30秒，52℃30秒，72℃15秒，30个循环，72℃7分钟。

5.根据权利要求1所述的一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，步骤(3)所测序获得的DNA序列需经多序列对比进行分析从而鉴定突变位置。