[发明专利]一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法

说明书

本发明提供一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，通过游离循环肿瘤DNA的提取、TP53基因4‑8号外显子PCR扩增、进行直接测序法检测TP53突变。本发明与现有传统PCR为基础的Sanger测序方法相比灵敏度高，特异性高。与二代测序方法相比检测快速、检测成本低、本发明的方法只需要常规PCR仪等常规实验室设备即可完成检测，适用平台广。本发明用外周血血浆中的游离循环肿瘤DNA替代肿瘤组织标本DNA，从而能够实现简便、及时、动态地检测TP53基因变异情况。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因的方法，是一种用于外周血血浆中检测游离循环肿瘤DNA人类TP53基因外显子突变的方法。

背景技术

肿瘤的发生是一个长期、多步骤的过程，重要基因的突变在肿瘤的发生发展过程中具有非常重要的作用。这些突变被认为与肿瘤的发生发展及治疗预后等有关。其中最为广泛关注的就是TP53基因，该基因在调节细胞周期、细胞增殖、凋亡、维持基因组稳定性等方面均具有重要的作用，该基因编码的p53蛋白是细胞周期的关键点调节蛋白，在细胞受到DNA损伤、低氧或原癌基因活化等应激刺激时负责阻滞细胞周期，从而使细胞可以修复或渡过应激状态，而p53蛋白突变后将导致细胞周期失调控、基因组不稳定、受损细胞的增殖失控等，这些均与肿瘤的发生及耐药有关。TP53基因突变在多种肿瘤如卵巢癌、肠癌、乳腺癌、肺癌及血液系统肿瘤中等均有发现，而且在包括血液系统肿瘤在内的多种肿瘤预后评估中具有重要的意义。在血液系统恶性肿瘤中，已经有骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)两种疾病的NCCN指南预后评估体系中把TP53突变作为高危预后因素进行推荐。美国梅奥医学中心(Mayo Clinic)关于多发性骨髓瘤(MM)的sMART指南中，也把TP53突变作为多发性骨髓瘤的高危预后因素。而且，近年来越来越多的文献证实在部分非霍奇金淋巴瘤如弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)和外周T细胞淋巴瘤等的预后危险因素分析中，TP53突变都是独立的高危因素。因此，TP53作为一个重要的肿瘤相关突变基因，在血液系统恶性肿瘤的预后评估中具有重要的意义。

传统的基因突变检测方法有基于PCR的Sanger直接测序法、基于定点突变位点检测的荧光定量PCR法等。这些方法均存在一定的不足，如PCR结合Sanger直接测序法只能对所检测的目的片段进行无差别的序列检测，检测效率低，灵敏度低，工作量大。基于定点突变位点的荧光定量PCR法只能针对已知的特定位点进行检测，而不能检测可能存在的未知的突变位点，检测结果不够全面和准确。近年来，二代测序也越来越多地应用于肿瘤突变基因的检测，随着检测深度的提高可以达到更灵敏的目的，但缺点在于检测成本高，耗时长。因此，设计一种简单方便而灵敏高效的TP53突变检测方法对于解决临床的实际需要具有重要的意义和价值。

由于临床标本取材量有限，尤其是淋巴瘤病理取材以粗针穿刺为多，病理标本的大小限制了临床检测，除了提供常规免疫组织化学检测用于病理类型诊断外，目前无法保证每个患者都有足够的标本用于所有预后因子的评估。而且在淋巴瘤及骨髓瘤的治疗过程中，随着疾病进程的演化尤其是在复发难治病例中，包括TP53基因突变在内的新的遗传学变异发生的可能性也增加，及时获得足够的肿瘤遗传学变异信息对于治疗方案的调整尤其重要，但通常在疾病进程中这一需要难以实现。把来源于肿瘤细胞凋亡代谢产生的游离循环肿瘤DNA(ctDNA)所承载遗传学信息的来代替原发灶肿瘤的遗传学信息，用于肿瘤疾病演化过程中发现新的遗传学变异，及时调整治疗方案和预后评估等在多种实体肿瘤中已经被证明是切实可行的。目前，ctDNA检测的主要技术手段包括：BEAMing、数字PCR、ARMS-PCR、TAM-PCR、CAPP-Seq、NGS等。Sanger’s测序法是最早、最成熟的DNA测序手段，但由于灵敏度较低，不能检测血液中微量的DNA，在常规的液体活检中没有应用价值。ctDNA检测技术中使用最广泛的是dPCR和ARMS，由于其成本低，灵敏度高，适合检测血液中微量的DNA。但是依然无法克服dPCR或ARMS的缺点：低通量，不能检测未知突变。二代测序技术(NGS)能够很好的弥补dPCR的ctDNA检测上的不足，但缺点是价格太高，目前难以在市场上推广。