[发明专利]一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法

说明书

本发明提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。采用本发明的培养方法30天可获得10¹⁰个左右的RASFs，细胞产率大大提高极高，可以满足多种实验需要，因此是一种快速有效的原代RASFS分离培养方法。同时原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，具有良好的实际应用之前景。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

类风湿关节炎(Rheμmatoid arthritis，RA)是一种涉及全身的自身免疫性疾病。RA的主要病理特征是关节炎滑膜慢性炎症反应，炎性细胞浸润，血管翳形成，骨和软骨进行性破坏。滑膜的过度增生和反复发作的剧烈炎症反应导致关节关节骨和软骨的破坏，造成关节磨损，关节功能障碍。虽然近年来人们对RA的治疗已经取得了一定的进展，但其具体的病因仍然不清楚。RASFs直接来源于病人病灶部位，其在RA患者骨和软骨破坏中起到重要的作用。在病患部位中大量的炎性细胞浸润使得RASFs大量增殖导致骨和软骨进行性破坏。近年来大量研究证实调控RASFs中的相关致病基因表达在RA诊断和治疗中有着较高的应用价值。

因此，目前在RA病理进程中的作用研究中，RASFs成为了滑膜功能研究的重要细胞模型之一。目前RASFs的原代培养方法主要包括组织块培养法和混合酶消化法。组织块培养法由于组织块与细胞培养器皿的贴附不牢靠，易脱落，而且培养周期长，消化时间不易控制，极易污染，成功率不高。而混合酶消化法将胰酶和胶原酶混合，进行组织消化，由于胰酶对细胞膜损伤较大，而滑膜细胞脱离组织的束缚、从组织块中爬出，需要较长的消化时间，对细胞膜的损伤极大，获得的细胞状态往往不好。以往研究虽然通过机械剪切对滑膜进行一定的破碎，然后使用混合酶消化法进行消化，一定程度上提高了原代RASFs的获取效率，但是发明人在实验过程中发现两个主要问题：1、RA组织以纤维性组织为主，而胶原酶能够非常有效的消化纤维性组织，并且胰酶对细胞的损害非常大，长时间的消化会导致大量细胞死亡。2、原有的提取方案没有对滑膜组织块的体积进行定量，极易使酶的过量或者不足，导致细胞死亡或者消化不充分，最终原代RASFs提取效率低。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，本发明通过对常规原代滑膜细胞提取方法进行优化，从而大大提高滑膜细胞提取效率，能够在短期内获得大量实验样本，不仅为后续类风湿性关节炎发病机制研究奠定了基础，而且能够大大缩短实验周期。且原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明的一个方面，提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：

将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；

培养消化后打散成单个细胞；

过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；

采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。

本发明的第二个方面，提供上述培养方法获得的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。

本发明的有益技术效果：