[发明专利]一种外周血免疫细胞的静置分离方法

权利要求书

1.一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，包括以下步骤：

1)将外周血样本转移至无菌细胞培养瓶中，混匀后，取0.5ml全血进行细胞计数；

2)将羟乙基淀粉加入到细胞培养瓶中，使羟乙基淀粉和外周血样本充分混匀；

3)混匀后将细胞培养瓶的盖子盖上，放在无菌操作台中进行静置，标记开始静置时间；

4)当分离上清液与沉淀的刻度达到1：1时，用移液管将富含PBMCs的血浆的分离上清液转移至新的离心管中，标记静置时间及上清体积；

5)混匀离心管中的分离上清液，取0.5ml计细胞数量及活率，将其余分离上清液经室温离心400g，10min；

6)离心后，将离心上清液转移至50ml离心管中留存，取16ml分别进行需氧菌和厌氧菌检测；离心管中剩余的免疫细胞根据计数结果加入冻存液，调整密度至0.5×10⁷/ml～4×10⁷/ml，混匀后进行冻存。

2.如权利要求1所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤2)中，羟乙基淀粉的加入量为：外周血体积：羟乙基淀粉体积＝5:1，外周血体积＝(采血袋总重量-采血袋空袋重量)/1.05。

3.如权利要求1或2所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤4)中，吸取分离上清液时，将培养瓶倾斜，用移液管沿着液面吸取；当上清液高度低于0.5-1cm时，可继续倾斜培养瓶，待稳定后，从上清液高度最高处以最缓慢的速度吸取。

4.如权利要求3所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤6)中，冻存所需的冻存液由CIK培养基、DMSO和人血白蛋白三种试剂依次按照18：1：1的体积比混合配制而成。