[发明专利]一种外周血免疫细胞的静置分离方法

说明书

本发明提出了一种人外周血免疫细胞的分离方法，本方法采用无菌容器静置的方式使外周血中免疫细胞实现分离，无菌容器静置法采用无菌容器静置的方式减少了离心作用对细胞的损伤，保证细胞的活率；同时静置分离法中添加羟乙基淀粉还能显著提高免疫细胞的回收率。

技术领域

本发明涉及一种外周血免疫细胞的静置分离方法，属于生物技术领域。

背景技术

人体免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，因此免疫细胞分离冻存具有非常大的意义。

目前外周血免疫细胞的分离主要采用Ficoll分离法，Ficoll分离法在分离过程中需要进行多次的离心操作，高速的离心对细胞容易造成一定的损伤，减少离心次数可以确保细胞的活率。Ficoll分离法使用淋巴细胞分离液进行分离，在吸取白膜层的过程中，损失细胞较多，回收率比较低，对于免疫细胞的冻存数量具有一定的影响，而在外周血免疫细胞分离过程中，羟乙基淀粉的加入可以促使红细胞加速沉降，从而提高免疫细胞的回收率。

发明内容

本发明针对上述问题，从而提出了一种外周血免疫细胞的静置分离方法。

具体的技术方案如下：

一种外周血免疫细胞的静置分离方法，包括以下步骤：

1)将外周血样本转移至无菌细胞培养瓶中，混匀后，取0.5ml全血进行细胞计数；

2)将羟乙基淀粉加入到细胞培养瓶中，使羟乙基淀粉和外周血样本充分混匀；

3)混匀后将细胞培养瓶的盖子盖上，放在无菌操作台中进行静置，标记开始静置时间；

4)当分离上清液与沉淀的刻度达到1：1时，用移液管将富含PBMCs的血浆的分离上清液转移至新的离心管中，标记静置时间及上清体积；

5)混匀离心管中的分离上清液，取0.5ml计细胞数量及活率，将其余分离上清液经室温离心400g，10min；

6)离心后，将离心上清液转移至50ml离心管中留存，取16ml分别进行需氧菌和厌氧菌检测；离心管中剩余的免疫细胞根据计数结果加入冻存液，调整密度至0.5×10⁷/ml～4×10⁷/ml，混匀后进行冻存。

进一步的，在步骤2)中，羟乙基淀粉的加入量为：外周血体积：羟乙基淀粉体积＝5:1，外周血体积＝(采血袋总重量-采血袋空袋重量)/1.05。

进一步的，在步骤4)中，吸取分离上清液时，将培养瓶倾斜，用移液管沿着液面吸取；当上清液高度低于0.5-1cm时，可继续倾斜培养瓶，待稳定后，从上清液高度最高处以最缓慢的速度吸取。

进一步的，在步骤6)中，冻存所需的冻存液由CIK培养基、DMSO和人血白蛋白三种试剂依次按照18：1：1的体积比混合配制而成。

本发明的有益效果为：

1)静置的方式减少了离心机的离心次数，易于操作，又避免离心对细胞造成的损伤，保证了细胞的活率；

2)在分离过程中加入了一定比例的羟乙基淀粉，加速了红细胞的沉降，提高了免疫细胞的回收率；

3)采用无菌容器的分离方式确保整个分离过程完全密闭，减少外源性污染，安全性高。

附图说明