[发明专利]RFP标记小细胞肺癌细胞系及其建立和应用

权利要求书

1.一种RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系，其特征在于，是以小细胞肺癌LTEP-P细胞株为母细胞，转染包装有RFP的pLEIN逆转录病毒，再经G418抗性筛选，获得稳定持续表达红色荧光蛋白的小细胞肺癌LTEP-P细胞系。

2.如权利要求1所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系的建立方法，其特征在于，包括：

将包装细胞PT67与含RFP基因的pLEIN质粒共培养以转染包装细胞PT67，再经G418抗性筛选，获得产病毒RFP阳性细胞克隆；

用所述产病毒RFP阳性细胞克隆转染小细胞肺癌LTEP-P细胞株，再经G418抗性筛选，获得所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系。

3.如权利要求2所述的建立方法，其特征在于，包括：

(1)将包装细胞PT67培养至70％-80％汇合度时，与转染试剂和含RFP基因的pLEIN质粒充分浸润，在室温共同混合孵育18小时后，置37℃、5％CO₂孵箱中培养48小时，再转入含200～1000μg/ml G418的RPMI 1640培养液中置于37℃、5％CO₂孵箱中培养7天，然后，转入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中并置于37℃、5％CO₂孵箱中培养18小时，得到含病毒载体的细胞上清液；

(2)分离步骤(1)所得的细胞上清液，并收集其中的病毒载体进行滴度测定，确定最佳病毒感染浓度，相应的细胞上清液待用；

(3)小细胞肺癌LTEP-P细胞生长至对数期时，用步骤(2)所确定的具有最佳病毒感染浓度的细胞上清液与RPMI 1640培养液按照1:1的体积比混合，共培养72小时；72小时后胰酶消化，1:1传代培养于含200μg/ml G418的RPMI 1640培养液中，培养过程中G418浓度逐步提高到800μg/ml；用克隆环分离表达RFP的克隆细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中置于37℃、5％CO₂、饱和湿度中培养扩增，收集LTEP-P-RFP肿瘤细胞。

4.如权利要求3所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，所述转染试剂为N-[1-(2,3-二油酰基)]-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐。

5.如权利要求1所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，为所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系用于在裸鼠中产生小细胞肺癌瘤块。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，为所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在建立小细胞肺癌裸鼠模型中的应用。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，为RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在作为小细胞肺癌发生、小细胞肺癌发展或小细胞肺癌转移的细胞模型中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，为RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在作为小细胞肺癌特异胸腔内转移的细胞模型中的应用。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，为所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在研究小细胞肺癌发生机理、耐药机理或筛选治疗小细胞肺癌药物中的应用。